Arricchimento selettivo e isolamento di batteri marini degradanti del petrolio da campioni di acqua di mare

Abstract

Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospezione di ceppi microbici per la biorimediazione e lo sviluppo di probiotici per la ricerca e la conservazione dei metaorganismi. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video dimostra l'isolamento selettivo dei batteri marini degradanti del petrolio arricchendo campioni di acqua di mare su mezzi a base di petrolio, permettendo il recupero di ceppi puri con potenziali applicazioni nella biorimediazione del petrolio greggio e nella pulizia ambientale.

Protocollo

1. Raccolta e stoccaggio di acqua e corallo per l'isolamento microbico

NOTA: È essenziale prendere le coordinate e la temperatura dei siti di campionamento. Se possibile, metadati come salinità, pH, profondità e intensità luminosa possono aiutare a individuare approcci di coltivazione più precisi e a future interpretazioni dei dati. Per risultati affidabili, conserva i campioni per il minor tempo possibile. I microbiomi dell'acqua/corallo possono cambiare notevolmente se i campioni non vengono mantenuti alla temperatura corretta e/o conservati per lunghi periodi. Se la fase di isolamento non viene eseguita immediatamente dopo la raccolta, è fondamentale mantenere i campioni a 4 °C fino alla lavorazione. Più a lungo i campioni vengono conservati, anche a 4 °C, più la comunità microbica cambierà.

1. Campiona e conserva l'acqua di mare.
   1. Raccogliere 500 mL di campioni d'acqua almeno triplicati da ciascun sito di campionamento target. Preferibilmente, usa bottiglie sterili con tappi a vite.
   2. Se si elabora l'acqua immediatamente dopo la prelievo, tieni le bottiglie a temperatura ambiente (RT) per un breve intervallo. Se la lavorazione del campione avviene in seguito, mantenere le bottiglie a 4 °C.
2. Campiona e conserva il corallo.
   1. Usa una pinza sterile per tagliare frammenti di corallo dallo stesso sito di campionamento dei campioni d'acqua. Per evitare contaminazioni, tocca i coralli solo con guanti sterili.
   2. Risciacquare il frammento di corallo campionato utilizzando soluzione salina sterile da 20 mL (3% di NaCl (cloruro di sodio) in acqua distillata) o acqua di mare artificiale per eliminare i batteri liberi e debolmente attaccati all'acqua di mare.
   3. Utilizzando una pinza, inserire ogni frammento di corallo in un contenitore sterile da 250−500 mL con un tappo a vite contenente soluzione salina sterile.
   4. In laboratorio, usando pinze e pinze sterili, pesare 5 g di frammenti di corallo usando piastre di Petri sterili da 100 mm x 20 mm su una bilancia.
   5. Trasferire i 5 g di campione di corallo in una malta sterile e macerarlo usando un pestello sterile.
   6. Utilizzando una spatola sterile, trasferire il campione macerato in una fiaschetta di coltura sterile contenente 45 mL di soluzione sterile di NaCl al 3% e 10−15 sfere di vetro da 5 mm. Usa un po' della soluzione salina sterile da 45 mL per lavare la malta e recuperare la massima quantità di macerato.
   7. Mantenere le fiaschette sotto agitazione costante (150 x g) per 16 ore alla temperatura dell'acqua del sito di campionamento.
      NOTA: Per i coralli di acque basse la temperatura ottimale varierà da 24 a 28 °C. Questo passaggio staccerà i microrganismi da diversi compartimenti corallini, come quelli attaccati alle cellule ospiti, o quelli che vivono all'interno del tessuto e dello scheletro. Dopo questo passaggio, i macerati di corallo non dovrebbero essere conservati e il passaggio di isolamento deve essere eseguito istantaneamente.

2. Isolamento dei batteri degradanti del petrolio dall'acqua di mare e/o dai coralli

1. Prepara un mezzo minimo contenente una frazione solubile in olio in acqua (oWSF) e una frazione insolubile in olio in acqua (oWIF) come unica fonte di carbonio.
   1. Aggiungi l'1−2% di petrolio greggio a 500 mL di acqua distillata sterile. Usa una fiaschetta filtrante aperta sul fondo per rimuovere la frazione solubile senza disturbare lo strato superiore della frazione insolubile.
   2. Mantenere la miscela sotto agitazione costante a 24−28 °C a 150 x g per 48 ore.
   3. Posizionare la fiaschetta filtrante contenente le frazioni di petrolio greggio su una superficie stabile e attendere 10−20 minuti per permettere la separazione delle frazioni solubili e insolubili.
   4. Trasferisci l'oWSF in una nuova fiaschetta sterile, risparmiando l'oWIF aprendo la fiaschetta inferiore del filtro e rimuovendo la frazione solubile.
   5. Utilizzando tutto l'oWSF recuperato nel passaggio precedente (~400 mL), preparare 1 L di mezzo BH (Bushnell Haas) con minimo agar contenente oWSF come unica fonte di carbonio.
   6. Utilizzando l'oWIF rimasto nella fiaschetta dal passaggio 2.1.4, preparare 1 L di mezzo agar minimo BH contenente oWIF come unica fonte di carbonio.
2. Isolare batteri degradanti oWSF e oWIF.
   1. Utilizzando acqua e macerata corallina dei passaggi 1.1.2 e 1.2.7, rispettivamente, diluire i campioni fino a ^10-6 in soluzione salina sterile come di seguito.
3. Esegui diluizioni seriali fino a ^10-9 in soluzione salina sterile per campioni di corallo e fino a ^10-6 per campioni d'acqua. La pipetta diluisce su e giù 5 volte prima di scartare la punta. Campiona il vortice per 5 secondi ogni volta prima di eseguire la successiva diluizione seriale.
4. Pipettare 100 μL di ciascuna diluizione su piatte di Petri contenenti substrati agar BH-oWSF e BH-oWIF e impiarle.
5. Incubare le piastre per 1−3 giorni alla temperatura desiderata (ad esempio, 26 °C). Controlla le targhe una volta al giorno.
6. Seleziona e isola le colonie che presentano morfologie di crescita distinte su nuove placche utilizzando la tecnica delle placche striate. Ripeti questo passaggio tutte le volte necessarie per avere colonie pure che crescano sulle placche.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bottiglia di stoccaggio per media PYREX da 500 mL	Thomas Scientific/Corning	1743E20/1395-500	Usava per campionare l'acqua.
Bottiglie aspiratrici da 500 mL	Thomas Scientific/Corning	1234B28/1220-2X	Usato per separare le frazioni dell'olio.
Pinza a taglio da 6 pollici	thomas scientific/Restek	1173Y64/23033	Usato per tagliare frammenti di corallo.
Agar	Himedia	PCT0901-1KG	Usato per fare media solide.
Brodo Bushnell Haas	Himedia	M350-500G	Utilizzato come mezzo minimo da integrare con fonti di carbonio.
Fiaschetta Erlenmeyer	Thomas Scientific/DWK Scienze della Vita (Kimble)	4882H35/26500-125	Usate per incubare il macerate corallino con perline di vetro.
Cappa a flusso laminare			Doveva lavorare in condizioni sterili.
Luria Bertani Broth, Munaio (Miller Luria Bertani Broth)	Himedia	M1245-1KG	Usati come substrati ricchi per far crescere batteri.
Agar marino 2216 (Agar marino Zobell)	Himedia	M384-500G	Usati come substrati ricchi per far crescere batteri.
Incubatore Oscillatore Orbitale			Usate per incubare mezzi liquidi e olio.
Incubatore di piastre			Usato per incubare le placche.
Mortaio e pestellino in porcellana	Thomas scientifico/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	Usata per macerare frammenti di corallo.
Centrifuga refrigerata			Usato per centrifugare colture batteriche.
Spettrofotometro			Utilizzato per misurare la densità ottica delle colture batteriche.
Kit di purificazione del DNA genomico Wizard	Promega	A1120	Utilizzato per l'estrazione di DNA di ceppi microbici.