Monitoraggio della crescita batterica a risoluzione di singola cellula in un sistema microfluidico

Abstract

Fonte: Cabeen, M. T., et al. Analisi microfluidica a singola cellula di Bacillus subtilis. J. Vis. Esp. (2018)

Il video mostra l'uso di un dispositivo microfluidico per osservare la crescita batterica a livello di singola cellula. Mostra come le cellule batteriche non mobili, confinate in trincee su scala microscopica, vengano continuamente nutrite e imaggiate sotto un microscopio a fluorescenza. L'installazione consente la visualizzazione in tempo reale della divisione cellulare e del tracciamento della linea di discendenza su più generazioni.

Protocollo

1. Cast dei dispositivi PDMS

1. In un ambiente privo di polvere, miscela polimero polidimetilsilossano (PDMS) e agente polimerico a un rapporto 10:1 e degas sotto vuoto per almeno 10 minuti.
2. Posiziona un master in silicone (o una replica in epossidica o poliuretano) su un pezzo di carta di alluminio intatta in una piastra di Petri in polistirolo. Versare la miscela di PDMS degassata sul master fino a una profondità di circa 5 mm. Degas la piastra di Petri per almeno 10 minuti. Usa un flusso d'aria delicato per rompere le bolle superficiali.
   NOTA: Una replica master in plastica può galleggiare parzialmente durante la degassazione; Se ciò accade, spingi la replica con un applicatore di plastica pulito.
3. Polimerizza il PDMS per almeno 1 ora in forno a 60 °C e raffredda a temperatura ambiente. Rimuovi la carta di alluminio contenente il master e il PDMS polimerizzato dalla piastra di Petri. Speggi con attenzione la carta stagnola dal retro del master, poi spegni con cura il PDMS dal master.
   NOTA: In alternativa, il PDMS può essere curato durante la notte a temperatura ambiente. La relativa fragilità di un master a wafer in silicio può essere superata utilizzando adesivo epossidico per legare permanentemente il wafer a un disco di alluminio spesso 1/16 di pollice, della dimensione stessa del wafer.
4. Poiché un wafer tipicamente include diversi dispositivi microfluidici con dimensioni leggermente diverse, taglia un singolo dispositivo a misura usando un bisturi pulito e affilato.
   NOTA: Per il lavoro di routine con Bacillus subtilis , si usano dispositivi con trincee di celle larghe 1,0 μm.

2. Punzonamento e legame del dispositivo

1. Posizionare un pezzo di nastro traslucido da ufficio (vedi Tabella dei materiali) sul lato decorato del dispositivo per migliorare la visibilità delle caratteristiche decorate. Le porte di ingresso e uscita sono identificate come aree circolari agli estremi opposti dei canali fluidici visibili (Figura 1). Per migliorarne la visibilità quando si praticano fori nel dispositivo per i pin di presa e ingresso, segna le prese e le prese con dei punti usando un pennarello a punta fine.
   NOTA: Per assicurarsi che i pin di ingresso e uscita non siano affollati, ogni canale alterno viene perforato, a partire dal canale appena sotto il designatore alfabetico del dispositivo.
2. Girare il dispositivo PDMS in modo che il lato decorato sia verso il basso e perforare il dispositivo fino ai punti segnati usando un puntino da biopsia da 0,75 mm; Scartare le perforazioni.
   NOTA: I dispositivi vengono perforati con il lato a pattern verso il basso perché il foro generato dal punch per la biopsia è tipicamente leggermente svasato dove il punch entra nel polimero. Punzonare il dispositivo in orientamento invertito garantisce che il foro sul lato decorato abbia un bordo netto.
3. Utilizzando uno stereomicroscopio, assicurati che i fori perforati si sovrappongano alle aree di ingresso e uscita del dispositivo. Usa pinzette a punta fine per rimuovere eventuali frammenti superflui di PDMS dai fori perforati.
4. Usa del nastro adesivo per rimuovere la polvere da entrambi i lati del dispositivo e inseriscilo in una piastra di Petri in polistirene pulita. Prepara un vetro da copertura da 22 mm x 40 mm bagnandolo con alcol isopropilico al 100% e strofinando con una salvietta per sala bianca; asciugare con un getto di aria o azoto priva di polvere.
5. Posiziona il dispositivo PDMS perforato con il lato verso l'alto insieme al vetro di copertura pulito in un detergente al plasma di ossigeno.
   1. Trattate il dispositivo con plasma con le seguenti impostazioni: vuoto, 70 mTorr; Pressione O₂, 200 mTorr; durata, 15 s; potenza, 30 W. Immediatamente dopo la fine del periodo di trattamento al plasma, rimuovere il dispositivo e coprire il vetro dal detergente al plasma.
   2. Inverti il PDMS e posizionalo al centro del vetro di copertura in modo che il lato decorato entri in contatto con il vetro; Assicurati che i canali di alimentazione (che corrono tra le aree di ingresso e uscita) siano allineati con l'asse lungo del vetro di copertura. Premi molto delicatamente per assicurarti che il PDMS sigilli contro il vetro.
6. Cuocere il dispositivo assemblato in forno per almeno 1 ora a 60 °C. Dopo la cottura, verifica manualmente che il PDMS sia legato al vetro premendo delicatamente su un angolo del dispositivo.
   NOTA: Una volta che il dispositivo è stato incollato, dovrebbe essere utilizzato entro 24 ore, poiché il polimero diventerà sempre più idrofobo con il passare del tempo dopo il trattamento al plasma.

3. Preparazione dell'impianto idraulico microfluidico

1. Tagliare le lunghezze del tubo polimerico (diametro interno (ID) 0,02 pollici, diametro esterno (OD) 0,06 pollici) a lunghezze appropriate da raggiungere dalla pompa della siringa all'apparecchio di commutazione (se utilizzato) e al dispositivo quando montato sul microscopio. Taglia quanti più lunghi ci sono corsie microfluidiche.
2. Assemblare giunzioni a Y per valvole di pinch (se utilizzate) tagliando e fissando lunghezze di tubo in silicone flessibile da 2 cm (diametro diametrale 0,03 pollici, diametro diametrale 0,065 pollici) alle barre superiori della "Y" e lunghezze di tubo in silicone da 1 cm alla spina inferiore della "Y".
3. Tagliare lunghezze di tubo polimerico di 10 cm (o appropriate); collegarli a un'estremità alla giunzione dello scambio inserendoli nei segmenti di tubo in silicone da 1 cm sulla spina inferiore della "Y". Collegali all'altra estremità a aghi da 21G che sono stati rimossi dagli adattatori di plastica per siringa e piegati di circa 90° circa 9 mm dall'estremità dell'ago.
4. Collega aghi smussati da 21G a un'estremità dei segmenti del tubo che andranno dalle siringhe all'apparato di interruttore inserendo gli aghi nel tubo. Inserire le altre estremità di ogni tratto di tubo nei segmenti di tubo in silicone sulle spine di ingresso delle giunzioni a Y.
   NOTA: Usa qualche tipo di apparecchio per tenere in posizione valvole di pinch e giunzioni; questo può essere facilmente realizzato con una scatola di punta per micropipette (Figura 2D).
5. Taglia lunghi tubi in polimero per trasportare i rifiuti dall'uscita del dispositivo a un becher per rifiuti. Collegali da un'estremità a aghi piegati da 21-G preparati come descritto sopra. Fissa l'altra estremità dei tubi in un becher di scarto.
6. Prepara volumi appropriati di substrati contenenti 0,1 mg/mL albumina sieroica bovina (BSA) e riempi la dimensione e il numero desiderati di siringhe. Collega le siringhe cariche con BSA agli aghi preparati da 21G collegati al tubo di ingresso e carica le siringhe nelle pompe per siringhe.
   NOTA: Per gli esperimenti tipici, vengono utilizzati 5 canali del dispositivo, ciascuno con una siringa da 20 mL. Un esperimento in cui il mezzo viene scambiato richiederà 2 banchi da 5 siringhe ciascuno. Qui, la pompa che contiene la prima banca è chiamata pompa di fase 1, mentre la pompa che contiene la seconda sponda, con il mezzo post-spostamento, è chiamata pompa di fase 2.
7. Spurgare l'aria dall'impianto di ingresso facendo funzionare le pompe delle siringhe a un alto flusso (>500 μL/min), iniziando orientando le pompe verticalmente e battendo le siringhe per portare bolle d'aria in superficie. Una volta che l'aria è stata spurgata dalle siringhe, posiziona la pompa orizzontalmente e sposta progressivamente i tubi polimerici dalle siringhe attraverso l'apparato di interruttore per spostare ed eliminare le bolle d'aria. Ripeti questo processo per la seconda banca di siringhe (se cambi supporto).
8. Dopo aver purgato le bolle d'aria, impostare la pompa della siringa di fase 2 (cioè con il mezzo usato in secondo, dopo l'interruttore) a 1,5 μL/min, poi mettere in pausa il flusso. Posizionare piccole clip per leganti sui segmenti di tubo flessibile sul ramo delle giunzioni a Y corrispondenti alla seconda fase media. Continuare a far funzionare la pompa di siringa di fase 1 a una portata modesta (ad esempio, 10 μL/min) per almeno 30 minuti per purgare il secondo mezzo dal tubo di ingresso a valle della giunzione Y.

4. Preparazione della coltura cellulare

1. Coltiva una precultura della ceppa di interesse nel mezzo desiderato da un giorno all'altro, fino alla fase stazionaria. Il ceppo batterico dovrebbe contenere una mutazione che renda le cellule immobili, così che le cellule non nuotino fuori dai canali del dispositivo.
   NOTA: In questo protocollo, il ceppo batterico è B. subtilis 3610 contenente una sostituzione A233V per la strega(questa mutazione rende il flagello dritto anziché elicoidale, impedendo la motilità cellulare), un segnalatore PrsbV-mNeonGreen per lo stress cellulare e un segnalatore costitutivo Phyperspank-mNeptune (rosso) per evidenziare le cellule. Il mezzo Lennox Luria-Bertani (LB) è utilizzato nell'esempio di protocollo. I ceppi tipici per esperimenti di microfluidica contengono uno o più reporter trascrizionali fluorescenti e una proteina fluorescente citoplasmatica prodotta costitutivamente per facilitare la rilevazione automatica delle cellule. Non sono stati osservati difetti di crescita quando si utilizzava un mezzo ricco di LB Lennox, ma la crescita di B. subtilis in mezzi minimi può essere inibita in condizioni microfluidiche perché i siderofori secreti vengono lavati via dal flusso del mezzo. In tali circostanze, la crescita può essere ripristinata aggiungendo citrato di sodio e cloruro ferrico al mezzo, come riportato per il mezzo S750.
2. La mattina dell'esperimento, diluire le cellule di B. subtilis per 1:50 in una fiaschetta da 250 mL con un filtro con 25 mL di mezzo di crescita. Far crescere le cellule per 5-6 ore in coltura shaked a 37 °C fino a una densità ottica superiore a 1.
   NOTA: Una coltura cellulare densa è preferibile perché le cellule di B. subtilis in fase stazionaria sono più piccole e meno frequenti nelle catene cellulari, facilitando il carico del dispositivo. Diverse specie batteriche possono richiedere altri mezzi o condizioni di crescita per un carico ottimale.
3. Utilizzando una siringa dotata di un filtro di dimensioni pori da 5 μm, filtra circa 15 mL di coltura cellulare in un tubo conico da 15 mL per rimuovere le catene cellulari di B. subtilis (non è necessario per E. coli e potrebbe non essere necessario per altre specie).
   NOTA: Relativamente poche cellule dovrebbero essere rimossi; Il filtrato dovrebbe essere torbido.
4. Centrifuga la coltura filtrata per 10 minuti a 4.000 x g a temperatura ambiente. Versare via il sovrantantante e risospendere la pellet cellulare nel liquido residuo di sovrantantante rimasto nel tubo, aggiungendo circa 500 μL di mezzo fresco se necessario per facilitare la pipettura della sospensione cellulare.

5. Caricamento del dispositivo

1. Posizionare delicatamente le punte vuote e sottili della micropipetta a carico di gel (vedi Tabella dei Materiali) nei fori di uscita del dispositivo microfluidico.
2. Utilizzando punte sottili a caricamento gel con una micropipetta P200, passivare il dispositivo iniettando un mezzo contenente 1 mg/mL di BSA nei fori di ingresso, osservando le punte nei fori di uscita per monitorare il riempimento dei canali microfluidici (Figura 2A). Incubare il dispositivo a temperatura ambiente per circa 5 minuti.
   NOTA: La BSA è comunemente utilizzata come agente bloccante o passivante che si lega alla superficie idrofobica del polimero PDMS, aumentando la sua idrofilicità e riducendo il legame di altre proteine o delle cellule (tramite molecole superficiali cellulari).
3. Utilizzando punte sottili a carico gel, caricare ogni canale con le celle sospese (dalla Sezione 4), utilizzando le punte nel canale di uscita per monitorare il progresso delle celle all'interno del dispositivo (Figura 2B).
   NOTA: Il carico è facilitato impostando la micropipetta P200 al suo volume massimo di 200 μL e poi aspirando un cuscinetto d'aria prima di aspirare un piccolo volume (circa metà del volume della sezione sottile della punta della pipetta) di cellule. Il volume delle celle risospese non deve necessariamente essere preciso, poiché il volume del dispositivo PDMS è piccolo rispetto a quello della micropipetta. Non conosciamo un limite superiore alla densità delle cellule risospese, purché la sospensione cellulare possa essere pipettata nel dispositivo. Gli ammassamenti cellulari possono ostruire il dispositivo e dovrebbero essere evitati tramite pipetting approfondito e/o miscelazione dei vortice.
4. Rimuovi delicatamente le punte di caricamento gel dai fori di uscita, lavorando una alla volta per evitare danni al dispositivo.
5. Centrifugare il dispositivo in una microcentrifuga da banco in un adattatore del rotore appropriato a circa 6.000 x g per 10 minuti (Figura 2C).
   NOTA: Fu utilizzato un adattatore di rotore in alluminio lavorato su misura, progettato per adattarsi a un rotore di microcentrifuga (Figura 2C); possono essere utilizzati diversi modelli di centrifughe con adattatori per rotori appropriati. La caratteristica importante dell'adattatore è che fornisce una forza laterale nella direzione delle estremità chiuse delle trincee delle celle, costringendo così le celle nei canali laterali.
6. Verifica il caricamento riuscito al microscopio (Figura 3), ma senza fissare il dispositivo al portavetri/inserto dello stage.
   NOTA: In questo protocollo, viene utilizzato un obiettivo a immersione in olio Ph3 a 60X e 1,4 NA sia per la verifica in questa fase che per l'imaging successivo.

6. Montaggio, bilanciamento e montaggio del dispositivo

1. Montare con cura il dispositivo caricato su un inserto dello stage fissando con nastro il vetro di copertura ai lati del PDMS sul fondo dell'insert dello stage (cioè, invertire l'insert dello stage prima di collegare il dispositivo). Inverti l'insieme dell'inserimento dello stadio in modo che il PDMS sia rivolto verso l'alto e posizionalo su una superficie morbida, come una pulizia senza polvere (Figura 2D).
2. Regola la portata della pompa a siringa di fase 1 a 35 μL/min. Lavorando con una corsia alla volta, inserisci l'ago di ingresso e poi quello di uscita (cioè, che va al becher di scarico; Figura 2E).
3. Pulisci l'eccesso di mezzo con una salvietta pulita e senza polvere e ispeziona visivamente il dispositivo per eventuali perdite. Esaminare il tubo di uscita per la presenza di cellule in eccesso (tipicamente una striscia torbida) e il menisco medio, che si muoverà lentamente verso il becher di scarto.
4. Lascia che il dispositivo funzioni a 35 μL/min per circa 15-30 minuti, finché tutte le corsie collegate non si scaricano nel becher di scarico.
5. Imposta la pompa della siringa di fase 1 a 1,5 μL/min e interrompi il flusso. Porta l'intero apparato di pompa e dispositivo al microscopio (questo processo è facilitato posizionando tutto su un carrello rotante) e riavvia il flusso di mezzo di fase 1 a 1,5 μL/min. Montare con cura l'inserto dello stage con il dispositivo su un microscopio a fluorescenza invertita, usando nastro adesivo se necessario per instradare i tubi di entrata e uscita.
6. Individua le posizioni desiderate sul dispositivo per l'imaging e inizia a fare l'imaging come desiderato. Si noti che le cellule richiedono tipicamente alcune ore (circa 10 generazioni) per raggiungere una crescita esponenziale in stato stazionario, e l'inizio dell'acquisizione dell'immagine può essere ritardato come desiderato, così che l'imaging inizi dopo il periodo di equilibrio.
   NOTA: La crescita in stato stazionario delle cellule mantenute in fase esponenziale dovrebbe essere verificata durante l'analisi delle immagini successiva monitorando i tempi di divisione cellulare e assicurandosi che abbiano raggiunto un valore minimo costante.

Risultati

Figura 1: Schema del dispositivo microfluidico. Uno schema del dispositivo viene mostrato approssimativamente in scala. Il designatore alfabetico è etichettato insieme alle zone di ingresso e uscita che vengono perforate per collegare gli a...

Materiali