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1. Condizioni di coltura batterica
- Lavorando sotto una cappa a flusso laminare, utilizzare 100 μL di una riserva di glicerolo di Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, immagazzinata a -80 °C) per inoculare 5 mL di mezzo Luria-Bertani (LB). Incubare a 30 °C mentre si scuote a 250 giri/min durante la notte.
- Il giorno successivo, risospendere 100 μL della coltura notturna in mezzo da 5 mL LB e incubare nelle stesse condizioni per 5 ore (fase esponenziale). Campiona una aliquota da 1 mL in un tubo da 2 mL, lascia raffreddare a temperatura ambiente (~15 min) e centrifuga (2300 x g per 5 minuti).
- Rimuovi il sovrantato e aggiungi 1 mL di buffer di motilità al pellet. Vortice brevemente per omogeneizzare il campione. Diluire per raggiungere la concentrazione cellulare desiderata, ad esempio 5 x 105 mL-1.
- Per esperimenti che coinvolgono comunità naturali, come quelle derivate dai corsi d'acqua, si prepara un mezzo di coltivazione non selettivo. Ad esempio, utilizzare acqua di torrente sterile e autoclavata o un mezzo artificiale per acqua di torrente arricciato con una fonte complessa di carbonio (LB).
2. Preparazione di un dispositivo microfluidico in polidimetilsossiano (PDMS)
- Progettare la geometria porosa desiderata tramite software di disegno assistito da computer (CAD), che consiste in una matrice di cerchi (cioè l'ostacolo impermeabile al flusso), descritta dalla dimensione del raggio e dalle coordinate centrali.
NOTA: Un esempio di geometria porosa con granula e dimensioni dei pori casuali è fornito nella Figura 1A. Un canale di osservazione senza ostacoli vicino all'uscita facilita l'acquisizione di curve di rottura (BTC). - In base alla geometria scelta, si prepara uno stampo utilizzando la fotolitografia standard SU-8.
NOTA: In alternativa, gli stampi possono essere ordinati anche da uno stabilimento dedicato alla microfabbricazione. Per ottenere un flusso di fluidi eterogeneo nel piano orizzontale, è importante progettare uno spessore della camera microfluidica dello stesso ordine di grandezza della dimensione media della gola dei pori. Tuttavia, assicurarsi che le dimensioni del dispositivo microfluidico siano adeguate all'osservazione al microscopio (ad esempio, lavorare su vetrine microscopiche). - Prepara 50 g di PDMS aggiungendo il 10% di reticolatore (dimetile, copolimero di metilidrogeno silossano) al 90% di elastomero in peso, utilizzando una siringa senza ago. Lavora in condizioni pulite ed evita la polvere il più possibile. Mescola i due reagenti in un contenitore pulito e usa e getta e applica il vuoto (100 mbar) per 30 minuti per rimuovere aria disciolta e bolle dal PDMS viscoso.
- Posiziona lo stampo in una piastra di Petri (100 mm di diametro, 15 mm di altezza). Versa il PDMS sullo stampo fino all'altezza desiderata (ad esempio, 2-5 mm). Copri la piastra di Petri e lasciala a 60 °C per 4 ore (tutta la notte per strati più spessi) per la stagione.
NOTA: Per scopi di visualizzazione, la luce dovrebbe poter attraversare il PDMS; Pertanto, uno strato sottile tra 2 mm e 5 mm è desiderabile. Gli strati più spessi (>5 mm) riducono la trasparenza del dispositivo, mentre quelli più sottili sono soggetti a deformazioni durante l'applicazione. - Rimuovi la muffa dal forno e lascia raffreddare il dispositivo microfluidico a temperatura ambiente. Una volta raffreddato, rimuovi con cura la porzione desiderata di PDMS con un bisturi.
NOTA: Forti pressioni sullo stampo causano fratture dello stampo. Non toccare il PDMS a mani nude, perché le impronte digitali influenzeranno la trasparenza ottica. - Sigilla temporaneamente la parte inferiore del canale PDMS (dove è stata incisa la geometria desiderata) con del nastro. Con un perforatore per biopsie di diametro 0,5 mm, perforare il canale microfluidico per creare un'entrata e un'uscita che si adattino al tubo di 0,5 mm (diametro interno).
NOTA: La natura morbida del PDMS garantirà la tenuta una volta inserito il tubo. I canali di entrata e uscita non possono essere realizzati dopo che il PDMS è stato sigillato al vetro. - Sigilla il canale microfluidico tramite legame plasma ossigeno utilizzando il generatore ad alta frequenza (plasma bonder, Tabella dei Materiali). Per questo, pulisci una lama di vetro silicato (25 mm x 75 mm) con etanolo e lascia asciugare. Rimuovi il nastro dal canale PDMS e posiziona il canale con il lato poroso rivolto verso l'alto. Trattare il vetrino in vetro silicato e le superfici PDMS con plasma per circa 45 secondi a temperatura ambiente.
- Posiziona il canale PDMS sul vetrino di vetro silicato e riscalda a 100 °C per 30 minuti su una piastra riscaldante.
- Rimuovi il dispositivo microfluidico dalla piastra riscaldante e raffreddalo a temperatura ambiente. Collega l'ingresso del canale PDMS con il tubo. Applica un vuoto per 30 minuti per rimuovere l'aria dal PDMS, che è quasi impermeabile ai fluidi ma permeabile ai gas.
- Prepara 100 mL di tampone di motilità (10 mM fosfato di potassio, 0,1 mM di etilendediaminaminatetraacetico (EDTA), integrato con 1% w/v glucosio, pH 7,0) e iniettare 1 mL nel dispositivo microfluidico utilizzando una pompa a siringa azionata a 10 μL min-1.
NOTA: Poiché il PDMS è sottosaturo di gas (a causa della precedente fase di vuoto), le bolle scompariranno entro ~30 minuti.
3. Analizzare il trasporto batterico utilizzando dispositivi microfluidici PDMS
- Posizionare il dispositivo microfluidico PDMS precedentemente saturato con il buffer di motilità sul palco del microscopio. Usa il nastro adesivo per fissare il tubo e minimizzare il disturbo del flusso durante il movimento della fase.
- Sposta il palco del microscopio sul canale di osservazione vicino all'uscita. Utilizzando la microscopia a campo chiaro o il contrasto di fase, si concentra sul centro del canale di osservazione e si regola l'ingrandimento per visualizzare le singole cellule batteriche.
- Imposta le impostazioni del percorso della luce su microscopia a fluorescenza e regola il tempo di esposizione della telecamera per risolvere le singole cellule batteriche (ad esempio, 100 ms), o in modo che i segnali di fluorescenza delle cellule siano almeno 3 volte più forti del rumore di fondo.
- Successivamente, inserire il tubo di ingresso in un tubo da 2 mL contenente la sospensione batterica. Invertire la direzione della pompa e iniziare a ritirare la sospensione a una portata di 1 μL min-1.
- Scansiona la sezione trasversale dell'intero canale di osservazione, registrando un'immagine composita ogni 2 minuti, per tutta la durata dell'esperimento.
