Trasfezione di un sistema di espressione genica induttibile in cellule che esprimono una proteina effettore batterica

Abstract

Fonte: Berens, C. et al. Applicazione di un sistema di espressione indutibile per studiare l'interferenza dei fattori di virulenza batterica con la segnalazione intracellulare. J. Vis. Esp. (2015)

Questo video dimostra l'uso di un sistema di espressione indutibile per identificare dove la proteina batterica effettrice CaeB interrompe la cascata apoptotica dell'ospite. Descrive i passaggi per la trasfettazione delle cellule che esprimono CaeB con un sistema sensibile alla tetraciclina per indurre l'espressione genica pro-apoptotica al fine di identificare il punto di interruzione all'interno della cascata.

Protocollo

1. Trasfezione della linea cellulare stabile con il sistema di vettori di espressione indotti

1. Semina cellule embrionali umane di rene (HEK)293 che esprimono stabilmente proteine fluorescenti verdi (GFP) o GFP-CaeB in una piastra a 12 pozzi con una densità di 1 x 10⁵ cellule per pozzo.
2. 19 ore dopo la semina, co-trasfettare le cellule con il plasmide regolatore e il plasmide di risposta, codificando Bax o la caspasi 3 attivata.
   1. Co-trasfettare le cellule stabili HEK293 con 100 ng di plasmide regolatore pWHE125-P (Figura 1) e 100 ng dei plasmidi di risposta pWHE655-hBax o pWHE655-revCasp3 (Figura 2) e 0,4 μl di polietilenimina.
   2. Prepara il reagente di trasfezione dell'acido desossiribonucleico (DNA) e quello di polietilenimina ciascuno in 75 μl di mezzo Opti-MEM e incuba per esattamente 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Per la formazione complessiva, incubare entrambe le miscele insieme per 15 minuti alla RT.
3. Aggiungi la soluzione di polietilenimina/DNA goccia alle cellule e incuba a 37 °C con il 5% di_CO2.

2. Induzione dell'apoptosi

1. 5 ore dopo la trasfezione, si induce l'espressione delle proteine pro-apoptotiche tramite l'aggiunta di 1 μg/ml di doxiciclina al mezzo di coltura. Incubare le cellule per 18 ore a 37 °C con il 5% di_CO2.

Risultati

Figura 1. Panoramica schematica del plasmide regolatorio pWHE125. Elementi essenziali per la propagazione nei batteri, tra cui un'origine di replicazione (ori pBR) e una cassetta di resistenza antibiotica contro l'ampicillina (Amp^...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
DMEM	Tecnologie vitali	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Pen/Streptococco	Tecnologie vitali	15140-122
OptiMEM	Tecnologie vitali	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Polietilenimina	Poliscieni	23966
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891