Monitoraggio continuo del rumore biologico nei batteri tramite microscopia a tempo indeterminato

Abstract

Fonte: Chaimovitz, E. A., et al. Misurazione continua del rumore biologico in Escherichia coli tramite microscopia a time-lapse. J. Vis. Esp. (2021)

Questo video dimostra la visualizzazione in tempo reale del rumore biologico in E. coli tracciando le fluttuazioni della fluorescenza della GFP durante la crescita e la divisione batterica tramite microscopia a time-lapse.

Protocollo

1. Preparazione del campione per l'imaging microscopico
   1. Togli la fiaschetta dal bagno d'acqua. Pulisci bene l'esterno della fiaschetta e lasciala raffreddare a temperatura ambiente (25 °C).
      NOTA: Rimuovi la fiaschetta circa 3 minuti prima della scadenza del timer.
   2. Versa costantemente 3 mL di gel sul perimetro della piastra in un movimento circolare. Lascia solidificare per qualche minuto.
   3. Sigilla le piastre con nastro e fori diversi fori con un ago da 25 G. Capovolgi tutti i piatti per evitare che la condensa d'acqua goccioli sul gel.
   4. Incubare tutte le ciotole a 4 °C per 30 minuti per permettere la solidificazione completa evitando la mitosi cellulare.
      NOTA: Lasciare i campioni a 4 °C per le misurazioni successive, non più di un giorno.
   5. Avvia il microscopio secondo le istruzioni del produttore.
   6. Trova la messa a fuoco iniziale usando l'obiettivo a minore amplificazione e attiva il sistema di messa a fuoco automatico (AFS).
   7. Usa olio se necessario, sommergi l'obiettivo con olio e spargilo con attenzione muovendo la piastra con un controller di piattaforma (non manualmente), e l'AFS può essere attivato di nuovo.
   8. Usa la sezione trasversale relativa nella direzione Z, seguendo il suggerimento predefinito per le sezioni a passo Z.
      NOTA: Scatta immagini in campo chiaro ogni 5 minuti e immagini fluorescenti ogni 20 minuti. A volte la messa a fuoco deve essere regolata nei primi 30 minuti. Preriscaldare la scatola dell'incubatrice del microscopio e l'olio, mentre il campione viene refrigerato, tende ad aiutare a ridurre la perdita iniziale di messa a fuoco.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di vetro da 35mm	Mattek	P35G-0.170-14-C	Spessore corrispondente alla lente del microscopio.
Agarosio	Lonza	5004	Preparazione LB
Eclipse Ti	Nikon		Microscopio rovesciato
Immersol 518F	Zeiss	4449600000000	Olio a immersione
Nastro parafilm	Bemis	PM-996	Chiamato nastro nel testo