Rilevamento dell'espressione di enzimi target nelle cellule batteriche geneticamente modificate

Abstract

Fonte: Kim, H. et al., Screening multienzimatico utilizzando un sistema di screening enzimatico genetico ad alto rendimento. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video mostra un metodo di screening genetico per rilevare l'espressione enzimatica utilizzando librerie metagenomiche di fosmide e substrati cromogenici. La citometria a flusso identifica e isola singole cellule che producono prodotti colorati, consentendo una selezione ad alta produttività delle cellule attive che esprimono enzimi.

Protocol

1. Preparazione della Metagenomic Library con un sistema di screening enzimatico genetico per la rilevazione del p-nitrofenolo (pNP) (pNP-GESS)
   1. Costruire una libreria metagenomica in Escherichia coli con un vettore fosmid utilizzando un kit di produzione di biblioteca fosmid.
   2. Aliquota 100 μl della libreria per la conservazione a −70 °C, che è una fonte di cellule della biblioteca metagenomica.
      NOTA: La densità ottica di un campione misurato a una lunghezza d'onda di 600 nm (OD₆₀₀) di questo stock di libreria è di circa 100.
   3. Scongelare 100 μl della libreria metagenomica standard su ghiaccio e inoculare in una fiaschetta da 500 ml contenente 50 ml di Luria-Bertani (LB) e 12,5 μg/ml cloranfenicolo, seguita da un'incubazione a 37 °C per 2 ore.
   4. Prelevare le cellule in un tubo conico da 50 ml tramite centrifugazione a 1.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
   5. Sosprive rapidamente il pellet in acqua distillata ghiacciata (DW) da 50 ml e centrifuga a 1.000 x g per 20 minuti a 4 °C.
   6. Risospendere il pellet in 50 μl di acqua fredda come ghiaccio con glicerolo al 10% (v/v). Usa 50 μl di questa aliquota della cella per l'elettroporazione.
   7. Inserire la miscela di celle elettrocompetenti da 50 μl e DNA pGESS(E135K) (100 ng) in una cuvetta di elettroporazione ghiacciata e elettroporare (1,8 kV/cm, 25 μF) la miscela.
   8. Aggiungi rapidamente 1 ml di brodo super ottimale con mezzo per la repressione catabolica (SOC) e risospendi delicatamente le cellule.
   9. Trasferire le cellule in un tubo a fondo rotondo da 14 ml usando una pipetta e incubare a 37 °C per 1 ora.
   10. Distribuire 500 μl delle cellule recuperate su una piastra quadrata LB di 20 x 20 cm contenente 12,5 μg/ml di cloranfenicolo e 50 μg/ml di ampicillina. Incubare il piatto a 30 °C per 12 ore.
   11. Raschiare le colonie con un raschiatore per cellule e raccogliere le cellule in un tubo conico da 50 ml utilizzando un mezzo di stoccaggio gelido.
   12. Centrifugare a 1.000 x g per 20 minuti a 4 °C. Sospendere il pellet in un mezzo di conservazione a celle gelate da 10 ml per raggiungere un OD₆₀₀ di 100.
   13. Aliquota 20 μl delle celle per la conservazione a −70 °C.
        
2. Rimozione dei falsi positivi dalla Metagenomic Library
   1. Scongelare le cellule della biblioteca metagenomica standard (dal Passo 1.13) contenenti DNA metagenomico fosmid e pGESS(E135K) su ghiaccio.
   2. Inoculare 10 μl delle cellule in 2 ml LB contenenti 50 μg/ml di ampicillina e 12,5 μg/ml di cloranfenicolo in un tubo a fondo rotondo da 14 ml. Incubare a 37 °C con tremolio a 200 giri/min per 4 ore.
   3. Nel frattempo, accendi la macchina FACS (cell sorter attivato dalla fluorescenza) e apri il software FACS predefinito. Usa le seguenti impostazioni: diametro della punta dell'ugello, 70 μm; Sensibilità dell'area di scatter frontale (FSC-A), amplificazione 300 V-logaritmica; Sensibilità dell'area di scatter laterale (SSC-A), amplificazione 350 V-logaritmica; sensibilità dell'area di isotiocianato fluoresceina (FITC-A), amplificazione 450 V-logaritmica; parametro soglia, valore FSC-A 5.
      NOTA: Le impostazioni tipiche sono fornite per il dispositivo FACS menzionato nella Tabella dei Materiali. Regola le impostazioni per altri dispositivi FACS.
   4. Diluire le cellule della biblioteca metagenomica del Passaggio 2.2 aggiungendo 5 μl del campione a un tubo a fondo arrotondato da 5 ml contenente 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   5. Posiziona il campione della libreria diluita sulla porta di caricamento dello strumento FACS e clicca sul pulsante Carica nella Dashboard di Acquisizione del software FACS.
   6. Regola la frequenza degli eventi a 1.000 - 1.500 eventi/secondo cliccando e controllando i pulsanti Flow Rate sulla dashboard.
   7. Crea un diagramma a scatter scalato logaritmico FSC-A rispetto a scala logaritmica SSC-A su un foglio di calcolo globale cliccando sul pulsante Dot Plot nella barra degli strumenti strumentali. Regola la porta a scatter R1 per includere gli eventi di singoletto (popolazione batterica) usando il pulsante Polygon Gate nella barra degli strumenti.
   8. Traccia un istogramma con il conteggio delle cellule rispetto al FITC-A scalato logaritmico nel foglio cliccando sul pulsante Istogramma. Successivamente, regolare la tensione FITC dalla scheda Impostazioni citometro nella finestra di Controllo Ispettore in modo che il picco della distribuzione a campana sia inferiore a 10² di FITC-A.
   9. Creare un FSC-A su scala logaritmica vs. il log traccia FITC-A cliccando sul pulsante Dot Plot nel foglio globale di lavoro. Imposta una porta di ordinamento R2 sul grafico usando il pulsante Porta Poligonale nella barra strumentale in modo che la porta sia posizionata tra il +5% e il -5% delle celle dal centro della distribuzione (un totale del 10% di celle attorno al picco della curva a campana).
   10. Posizionare un tubo di raccolta contenente 1,2 ml LB contenente 50 μg/ml di ampicillina e 12,5 μg/ml cloranfenicolo all'uscita dello strumento FACS e selezionare 10⁶ celle che soddisfano sia le porte R1 che R2.
   11. Rimuovi il tubo di raccolta, il tappo e vortice delicatamente.
        
3. Screening degli enzimi metagenomici
   1. Incubare le cellule ordinate (dal Passo 2.11) a 37 °C con agitazione a 200 giri/min finché il diametro₆₀₀ non raggiunge 0,5.
   2. Aggiungere una soluzione di induczione di copia di 1 μl per amplificare il numero di copie intracellulari del fosmide. Incubare le cellule per altre 3 ore a 37 °C con scuotimento a 250 giri al minuto.
   3. Per preparare le cellule alla classificazione, si aggiungono 0,5 ml delle cellule coltivate e un substrato appropriato (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-cellobioside, o fenil fosfato) in un tubo a fondo arrotondato da 14 ml a una concentrazione finale di 100 μM.
      1. Per un campione di controllo, aggiungere 0,5 ml delle cellule coltivate dello Passo 3.2 in un tubo a fondo rotondo da 14 ml. Aggiungi lo stesso volume di PBS del volume del substrato nel Passo 3.3.
   4. Incubare i due campioni a 37 °C con scuotere a 200 giri/min per 3 ore.
   5. Nel frattempo, prepara la macchina FACS con le stesse configurazioni dello Step 2.3.
   6. Aggiungere 5 μl delle celle (per la classificazione) e le celle di controllo a due tubi da 5 ml a fondo arrotondato contenenti rispettivamente 1 ml PBS.
   7. Posiziona il tubo contenente celle di controllo sulla porta di carico del FACS e clicca sul pulsante Carica nel Dashboard di Acquisizione del software FACS. Regola la velocità degli eventi a 1.000 - 3.000 eventi/secondo controllando i pulsanti Flow Rate sul cruscotto.
   8. Crea diagramma a scatter scalato logaritmico FSC-A rispetto a scala logaritmica SSC-A cliccando sul pulsante Dot Plot nel foglio globale del software, e regola la porta di scatter R1 per includere gli eventi singlet (popolazione batterica) usando il pulsante Polygon Gate nella barra strumentale.
   9. Crea un diagramma a scatter FITC-A scalato logaritmico rispetto a FITC-A scalato logaritmico cliccando sul pulsante Dot Plot nel foglio di lavoro, e imposta una porta di ordinamento R2 sul grafico usando il pulsante Porta Poligonale nella barra strumentale, in modo che meno dello 0,1% delle celle negative vengano rilevate all'interno della porta R2.
   10. Sostituire il tubo campione di controllo con quello di selezione e regolare la frequenza degli eventi a 1.000 - 3.000 eventi/secondo controllando i pulsanti Flow Rate sul cruscotto.
   11. Posizionare un tubo di raccolta contenente 0,5 ml LB all'uscita dello strumento FACS e ordinare 10^{celle da 4} che soddisfano sia le porte R1 che R2.
       NOTA: Il criterio di ordinamento può variare dallo 0,1% superiore al 5% del FITC-A nella porta R2. In questo protocollo, l'1% superiore delle cellule è stato raccolto come positivo.

Materials