In vitro Modello di coltura batch-coltura per imitare la fermentazione colonica da parte del microbiota intestinale umano

Abstract

Fonte: Ahmadi, S., et al. Un modello di batch-culture in vitro per stimare gli effetti dei regimi interventistici sul microbiota fecale umano. J. Vis. Esp. (2019).

Questo video dimostra un metodo per modellare la fermentazione microbica intestinale incubando campioni fecali con fibre fermentabili alimentari in condizioni anaerobiche per studiare la produzione di metaboliti da parte del microbiota intestinale.

Protocollo

Tutte le procedure relative alla raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

CAUTELA: Consultare le appropriate Schede Dati di Sicurezza dei Materiali e seguire le istruzioni e le linee guida per una formazione adeguata al Biosafety Level 2 (BSL-2). Segui tutti i passaggi di coltivazione secondo le norme standard di biosicurezza e utilizza un armadio BSL-2 in condizioni asettiche. Inoltre, i campioni fecali di diversi modelli e soggetti umani possono avere un potenziale rischio di diffusione di malattie trasmesse da microbi. Cercate immediatamente assistenza medica in caso di infortunio o infezione. Inoltre, l'uso di campioni di feci umane e animali dovrebbe essere approvato da comitati etici istituzionali e deve rispettare i protocolli per l'uso di campioni e informazioni sui soggetti.

1. Preparazione dei Media Culturali

1. Preparazione del materiale di coltura, preparare nove tipi di soluzioni di stock:
   1. Soluzione A (1.000 mL): Sciogliere 5,4 g di cloruro di sodio (NaCl), 2,7 g di fosfato di diidrogeno di potassio (KH₂PO₄), 0,16 g di cloruro di calcio diidrato (CaCl 2,2H₂O), 0,12 g di cloruro di magnesio esaidrato (MgCl_{2,6H 2}O), 0,06 g di cloruro di manganese tetraidrato (MnCl_{2,4H 2}O), 0,06 g di cloruro di cobalto esaidrato (CoCl_{2,6H 2}O) e 5,4 g di solfato di ammonio (NH₄)2SO₄, in acqua deionizzata per portare il volume totale a 1.000 mL.
   2. Soluzione B (1.000 mL): Dissolvere 2,7 g di fosfato di potassio idrogeno (K_{2HPO 4}) in acqua deionizzata per raggiungere il volume totale di 1000 mL.
   3. Soluzione di minerali in traca (1.000 mL): Sciogliere 500 mg di etiledeniamina-tetraacetato disodio diidrato (Na₂EDTA), 200 mg di solfato ferroso eptaidrato (FeSO_{4,7H 2}O), 10 mg di solfato di zinco eptaidrato (ZnSO_{4,7H 2}O), 3 mg di cloruro di manganese(II) tetraidrato (MnCl_{2,4H 2}O), 30 mg di acido fosforico (H₃PO₄), 20 mg di CoCl 2,6H ₂O, 1 mg di cloruro cuprico diidrato (CuCl 2,2H₂O), 2 mg di cloruro di nichel(II) esaidrato (NiCl_{2,6H 2}O) e 3 mg di molibdato di sodio diidrato (Na₂MoO_{4,2H 2}O) in acqua deionizzata per raggiungere il volume totale di 1.000 mL.
      NOTA: Questa soluzione è sensibile alla luce, quindi assicurati di conservarla in tubi/bottiglie scure o nere o in alluminio.
   4. Soluzione vitaminica idrosolubile in acqua (1.000 mL): Sciogliere 100 mg di tiamina cloridrato (Tiamina-HCl), 100 mg di acido D-pantotenico, 100 mg di niacina, 100 mg di piridossina, 5 mg di acido P-aminobenzoico e 0,25 mg di vitamina B12 in acqua deionizzata per raggiungere un volume totale di 1.000 mL.
   5. Folato: soluzione di biotina (1.000 mL): Sciogliere 10 mg di acido folico, 2 mg di D-biotina e 100 mg di bicarbonato di ammonio (NH_{4HCO 3}) in acqua deionizzata per raggiungere un volume totale di 1.000 mL.
   6. Soluzione di riboflavina (1.000 mL): Dissolvere 10 mg di riboflavina in 5 mM di soluzione HEPES (4-(2-idrossietil)piperazina-1-acido etanosulfonico) (1,19 g/L) per raggiungere un volume totale di 1.000 mL.
   7. Soluzione di Hemin (10 mL): Sciogliere 5.000 mg di Hemin in una soluzione di idrossido di sodio (NaOH) (0,4 g/L) da 10 mM per portare il volume totale a 10 mL.
   8. Miscela di acidi grassi a catena corta (10 mL): Combinare 2,5 mL di N-valerato, 2,5 mL di isovalerato, 2,5 mL di isobutirato e 2,5 mL: DL-α-metilbutirato.
      NOTA: Questa soluzione è consigliata da utilizzare in una cappa per evitare odori e fumi.
   9. Resazurina (1.000 mL): Sciogliere 1 g di resazurina in acqua deionizzata e portare il volume totale a 1.000 mL.
2. Mezzo utilizzato per la fermentazione anaerobica in vitro
   1. Per preparare questo mezzo, miscela 330 mL di Soluzione A, 330 mL di Soluzione B, 10 mL di soluzione di minerali trace, 20 mL di soluzione vitaminica idrosolubile, 5 mL di folato: soluzione di biotina, 5 mL di soluzione di riboflavina; 2,5 mL di soluzione di Hemin, 0,4 mL di miscela di acidi grassi a catena corta, 1 mL di Resazurina, 0,5 g di estratto di lievito, 4 g di carbonato di sodio (_{Na 2}CO₃), 0,5 g di Cisteïna HCl-H2O e 0,5 g di tripticasa, aggiungendo 296,1 mL di acqua distillata.
   2. Controlla il pH e assicurati che sia intorno a 7,0; se no, regola il pH con 1 N HCl o 1 N NaOH. Sterilizza filtrando il substrato a vuoto usando un filtro a bottiglia sotto la postazione asettica.
   3. In alternativa, mescola tutti i componenti (tranne le vitamine e le soluzioni di emini) e l'autoclave a 121 °C per 20 minuti e lascia raffreddare a temperatura ambiente. Contemporaneamente, filtrare e sterilizzare le soluzioni vitaminiche ed emini utilizzando filtri a membrana da 0,22 μm e aggiungere queste soluzioni ai mezzi autoclavi e raffreddati prima di dispensarle.

2. Preparazione della camera anaerobica e dei materiali necessari

1. Conservare tutti i materiali, le soluzioni e gli strumenti necessari per l'esperimento di fermentazione all'interno della camera anaerobica almeno 48 ore prima dell'inizio dell'esperimento, per assicurarsi che qualsiasi ossigeno residuo associato agli utensili e ossigeno solubile in tamponi/soluzioni venga rimosso e che tutti i materiali siano acclimatati alle condizioni anaerobiche stabilite.
   NOTA: Materiali necessari all'interno della camera anaerobica (48 ore prima dell'inizio dell'esperimento): (i) mezzo di fermentazione; (ii) soluzione anaerobica (preparata secondo la sezione 4.1), (iii) vortexer, (iv) bilancia, (v) garpe di formaggio in mussolina, (vi) forbici, (vii) imbuto, (viii) tubi da 1,5, 2,0, 15, 50 mL, (ix) pipettor (2, 20, 200 e 1.000 μL) e punte compatibili per pipette, (x) pipetta da cannone e pipete (5 e 10 mL), (xi) fazzoletti di carta, (xii) marcatori, (xiii) sondetti per tubi diversi, (xiv) scatola dei rifiuti, (xv) indicatore di O2 e (xvi) bottiglia spray al 70% di etanolo (disinfettante).

3. Preparazione di tubi e fibre

1. Pesare 300 mg di inulina e trasferirsi in un tubo da 50 mL, seguito dall'aggiunta asettica di 26 mL di mezzo di fermentazione già preparati e conservati nella camera anaerobica. Prepara un tubo vuoto per ogni tipo di campione fecale e per ogni tubo sperimentale (a seconda del numero di composti testati), in triplice.
2. Lasciare questi tubi all'interno della camera anaerobica per circa 24 ore per permettere l'idratazione dei campioni prima di iniziare l'esperimento di fermentazione. Assicurati che la temperatura del tubo sia di 37 °C al momento dell'inoculazione, quindi porta i tubi nell'incubatrice chiusi nella camera anaerobica.

4. Preparazione dell'inoculo

1. Soluzione di diluizione anaerobica (almeno 48 h prima dell'esperimento di fermentazione): Sciogliere 5 g di NaCl, 2 g di glucosio e 0,3 g di Cisteina-HCl in acqua deionizzata e raggiungere il volume totale a 1.000 mL. Autoclave e conservalo nella camera anaerobica almeno 48 ore prima dell'uso.
2. Preparazione dell'inoculo fecale (al giorno dell'esperimento di fermentazione): Pesare 5 g di campione fecale fresco in un tubo conico da 50 mL, aggiungere soluzione di diluizione anaerobica per un volume finale di 50 mL (1:10 w/v) e far lavorare per 15 minuti o fino a essere completamente omogeneizzato. Filtra la miscela omogeneizzata attraverso 4 strati di garza sterile (autoclavata) e usala immediatamente per l'inoculazione nei tubi contenenti il substrato.
   NOTA: I campioni fecali di un gruppo di soggetti possono essere messi in comune se l'obiettivo sperimentale è confrontare l'effetto di un determinato composto/ingrediente sul microbiota fecale complessivamente sano rispetto a quello malato in generale.

5. Fermentazione e campionamento

1. Preparare i tubi secondo la sezione 4.2 e inoculare i tubi in bianco/controllo e sperimentali con 4 mL di inoculo fecale diluito e filtrato. Incubare i tubi inoculati a 37 °C all'interno della camera anaerobica. Scuoti i tubi una volta ogni ora invertendoli delicatamente per risospendere le fibre e l'inoculo.
2. Raccogli campioni con la frequenza necessaria, ad esempio ogni ora fino a 0, 3, 6, 9 e 24 ore durante la fermentazione, prelevando un campione di 2 mL di aliquota in un tubo da 2 mL dai rispettivi tubetti di fermentazione.
3. Misurare il pH delle aliquote utilizzando un misuratore di pH da laboratorio (inserendo direttamente l'elettrodo di pH nel campione); centrifugare il campione rimanente a 14.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Congelare immediatamente il soprandanante e la pellet in azoto liquido e, dopo il congelamento improvviso, conservare il soprandanante per l'analisi degli SCFA (acidi grassi a catena corta) e il pellet per l'analisi del microbioma a -80 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Bicarbonato di ammonio	Sigma-Aldrich	217255
Solfato di ammonio	TGI	C2388	Tossico
Cloruro di calcio diidrato	Sigma-Aldrich	C3306	Irritante
Cloruro cobalto esaidrato	Sigma-Aldrich	255599
Diidrato di cloruro cuprico	Acros organici	2063450000	Tossico, irritante
Cisteina-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-biotina	Sigma-Aldrich	B4501
Acido D-Pantotenico	Alfa Aesar	A16609
Didiidrato disodico etilendediamina, tetraacetato	Biorad	1610729
DL-α-metilbutirato	Sigma-Aldrich	W271918
Solfato ferroso eptaidrato	Sigma-Aldrich	F8263	Tossico
Acido folico	Alfa Aesar	J62937
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Isobutirato	Alfa Aesar	L04038
Isovalerato	Alfa Aesar	A18642
Cloruro di magnesio esaidrato	Sigma-Aldrich	M8266
Cloruro di manganese tetraidrato	Sigma-Aldrich	221279
Niacina (acido nicotinico)	Sigma-Aldrich	N4126
Cloruro di nichel(II) esaidrato	Alfa Aesar	A14366	Tossico
N-valerato	Sigma-Aldrich	240370
Acido P-aminobenzoico	MP Cina	102569	Tossico, irritante
Acido fosforico	Sigma-Aldrich	P5811
Fosfato diidrogeno di potassio	Sigma-Aldrich	P5504
Fosfato di idrogeno di potassio	Sigma-Aldrich	1551128
Piridossina	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Riboflavina	Alfa Aesar	A11764
Soda	Sigma-Aldrich	1613757
Cloruro di sodio	BioReagenti Fisher	7647-14-5
Idrossido di sodio	Fisher Chemicals	S320
Molibdato di sodio diidrato	Acros organici	206375000
Cloridrato di tiamina	Acros organici	148991000
Tripticase	BD in Biologia	211921
Vitamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Estratto di lievito	Sigma-Aldrich	70161
Solfato di zinco eptaidrato	Sigma-Aldrich	Z0251
Filtro a membrana da 0,22 μm
Sfere magnetiche di purificazione AMPure	Agencourt
Camera anaerobica con incubatore	Sistema anaerobico forma, Thermo Scientific, USA
Filtro a bottiglia	Corning
Garza
Misuratore di pH
Vortice	Termoscientifico