Fermentazione microaerobica dell'idrolizzato di bambù da Klebsiella pneumoniae

Abstract

Fonte: Wei, D., et al., Produzione di sostanze chimiche da parte di Klebsiella pneumoniae utilizzando idrolizzato di bambù come materia prima. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video dimostra la conversione microbica di zuccheri derivati dal bambù in 2,3-butanediolo coltivando Klebsiella pneumoniae in un mezzo a base di idrolizzato in condizioni microaerobiche e lievemente acide.

Protocollo

1. Produzione di 2,3-Butanediolo da parte di K. pneumoniae di tipo selvatico

1. Usa 3 litri di idrolizzato di bambù come solvente per la preparazione del mezzo.
2. Prepara un mezzo di fermentazione contenente 4 g/L di liquore in immersione di mais, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K_{2HPO 4}, 3 g/L_{KH 2}PO₄ e 0,2 g/L MgSO₄. Regola il pH del mezzo a neutro usando 2,5 M NaOH. Utilizzare un bioreattore da 5 L contenente 3 L di mezzo di fermentazione autoclaviata per la fermentazione.
3. Usa cellule di K. pneumoniae conservate in un frigorifero a bassa temperatura a -80°C.
4. Per la coltura dei semi, incubare una fiaschetta da 250 mL contenente 50 mL di mezzo Luria-Bertani (LB) durante la notte a 37 °C, con agitazione a 200 giri/min. Usa un medium LB contenente 10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito e 10 g/L di NaCl. NOTA: La densità cellulare della coltura dei semi dovrebbe raggiungere OD 2 (densità ottica a 600 nm).
5. Inoculare una fiaschetta di 50 mL della coltura dei semi nel bioreattore. Mantieni la coltura a pH 6,0 e 37 °C. Usa una densità di integrazione con aria di 2 L/min e una velocità di agitazione di 250 rpm, creando una condizione microaerobica.
6. Raccogli 5 mL di campioni ogni 2 ore durante la fermentazione e analizzali con cromatografia liquida ad alta pressione per determinare le concentrazioni chimiche nel brodo.
7. Monitorare online l'alcalino aggiunto al bioreattore utilizzando sistemi a celle a combustibile microbiche/acquisizione dati o MFCS/DA.
   NOTA: Gli acidi organici vengono prodotti durante il processo di fermentazione e viene aggiunto NaOH per mantenere stabile il pH della coltura. Il volume di alcali aggiunti rappresenta la quantità di acido prodotto. Quando la linea aggiunta agli alcalini si stabilizza, il processo è terminato, sia a causa dell'esaurimento delle fonti di carbonio sia della morte cellulare.

2. Produzione di R-acetoina da parte del mutante budC di K. pneumoniae

1. Prepara un mezzo per la produzione di acetoina contenente 4 g/L di liquore a maco di mais, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L di acetato di sodio, 0,4 g/L di KCl e 0,1 g/L di_{MgSO 4}.
2. Utilizzare K. pneumoniae-ΔbudC per la produzione di R-acetoina. Ripeti i passaggi 1.4-1.5.
   NOTA: budC codifica 2,3-butanediolo deidrogenasi. K. pneumoniae-ΔbudC perde l'attività 2,3-butanediol deidrogenasi e produce R-acetoin invece del 2,3-butanediolo.
3. Mantieni la coltura a pH 6,0 e 37 °C. Utilizza un tasso di integrazione in aria di 4 L/min e un tasso di agitazione di 450 rpm, una condizione aerobica.
   NOTA: L'integrazione di ossigeno è superiore rispetto alla produzione di 2,3-butanediolo.
4. Analizza i campioni come nel passo 1.6.

3. Produzione di 2-Acido Chetogluconico da parte del mutante budA di K. pneumoniae

1. Per la produzione di acido 2-chetogluconico, si utilizza lo stesso mezzo della produzione di R-acetoina.
2. Usa K. pneumoniae-ΔbudA per la produzione di acido 2-chetogluconico. Ripeti i passaggi 1.4-1.5.
   NOTA: budA codifica α-acetolattato decarbossilasi. K. pneumoniae-ΔbudA perde l'attività della decarbossilasi α-acetolattato e produce acido 2-chetogluconico, utilizzando il glucosio come substrato.
   NOTA: la sintesi dell'acido 2-chetogluconico è un processo acido dipendente dalla condizione. È stata sviluppata una fermentazione in due fasi per la produzione di acido 2-chetogluconico; Nella prima fase, la coltura dei semi viene inoculata nel bioreattore.
3. Mantieni la coltura a pH 7,0 e 37 °C. Usa un tasso di integrazione in aria di 4 L/min e un tasso di agitazione di 500 rpm.
   NOTA: In queste condizioni, le cellule crescono molto velocemente (la densità cellulare raggiunge OD 7 in circa 4 ore). Successivamente, la fermentazione prosegue alla seconda fase, durante la quale il pH della coltura scende a 5,0. Non viene aggiunto acido; gli acidi organici prodotti nella coltura portano naturalmente a una diminuzione del pH. In queste condizioni acide, la crescita cellulare si ferma, ma l'acido 2-chetogluconico viene sintetizzato e si accumula nel brodo.
4. Analizza i campioni come nel passo 1.6. Utilizzando l'idrolizzato del bambù come fonte di carbonio.
   NOTA: Il glucosio nel mezzo viene convertito in acido 2-chetogluconico, mentre lo xilosio viene convertito in acido xilonico. Così si ottiene una miscela di acido 2-chetogluconico e acido xilonico.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Autoclave	SANYO	3780
Bioreattore	Sartorius Stedim biotech	Bostat Aplus
Agitatore	IKA	RW 20
Sistema di cromatografo liquido ad alte prestazioni	Shimadzu Corp	20AVP
Polvere di bambù	Acquistato dalla provincia di Zhejiang, Cina		Numero di mesh, 50
Cellulasi	Lo dici a Biochemical, Shandong, Cina		200 PFU/mL