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1. Estrazione dei metaboliti
- Lo scongelamento campioni su ghiaccio umido e la disorganizzazione delle celle in un omogeneizzatore con quattro scoppi da 30 secondi a 6.000 giri/min, con periodi di raffreddamento di 2 minuti su ghiaccio secco tra un ciclo e l'altro.
- Chiarire i lisati per 15 minuti in una microcentrifuga refrigerata e pre-raffreddata alla massima velocità (ovvero 18.213 x g a ≤4 °C).
- Trasferisci il sovrantantante in un tubo pulito per microcentrifuga.
- Utilizzando una micropipetta, trasferire una piccola porzione del campione in un tubo microcentrifuga per la quantificazione del contenuto residuo di peptidi nel passaggio 2; conservare il resto a -80 °C.
NOTA: Il volume del campione riservato varia a seconda del saggio sull'acido bicinconinico (BCA) utilizzato nello step 2.1. Questo campione dovrebbe essere conservato su ghiaccio umido per un'analisi immediata o congelato a -80 °C.
2. Saggio sull'Acido Bicinconinico (BCA)
- Eseguire un test BCA come raccomandato dal produttore del kit, utilizzando campioni dello step 1.4 per determinare la concentrazione residua di peptidi per ciascun campione.
3. Cromatografia liquida-Spettrometria di massa (LC-MS)
- Miscela 75 μL di estratto di Staphylococcus aureus (S. aureus) con 75 μL di solvente LC-MS B, preparato nello step 1.4.
- Vortice da mescolare e centrifugare a 13.000 x g per 5 minuti.
- Inserire 100 μL di sovrantantante in una fiala per cromatografia liquida (LC) e tapparla. Assicurati che nessuna bolla d'aria sia intrappolata nel campione.
- Carica le fiale LC sull'autocampionatore LC-MS e modifica la lista in esecuzione nel software "Offline Worklist Editor."
- Compila le colonne "Nome Campione" (ad esempio, tipo wild-1), "Posizione del Campione" (ad esempio, P1-A1), "Metodo" (ad esempio, Metodo Acido Formico Negativo) e "File Dati" (ad esempio, tipo selvaggio 1). Clicca sul pulsante "Salva lista di lavoro". Apri il software "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" e inserisci la lista di lavoro precedentemente salvata. Clicca sul pulsante "Avvia Esecuzione della Lista Lavoro" per avviare la misurazione continua LC-MS.
- Separare i campioni su una colonna, collegare la colonna a uno spettrometro del tempo di volo (TOF) e accoppiare lo spettrometro TOF con il sistema LC. Usa un gradiente di fase mobile come segue: 0-2 min, 85% solvente B; 3-5 minuti, 80% solvente B; 6-7 minuti, 75% solvente B; 8-9 minuti, 70% solvente B; 10-11,1 minuti, 50% solvente B; 11,1-14 min, 20% solvente B; e 14,1-24 min, 5% di solvente B; terminare con un periodo di riequilibrio di 10 minuti all'85% di solvente B e una portata di 0,4 mL min-1.
- Utilizzando una pompa isocratica, infondere una soluzione di massa di riferimento nella pista per permettere la calibrazione simultanea degli assi di massa.
NOTA: Questo passaggio si basa sul manuale standard dello spettrometro TOF.- Utilizzare la miscela di acido acetico D4 e fosfazia esakis (1H,1H,3H-tetrafluoropropoxy) come soluzione di massa di riferimento per effettuare la calibrazione in tempo reale. Usa la pompa isocratica con portata di 2,5 mL min-1 per l'infusione.
4. Correzione batch del conteggio degli ioni
- Designa qualsiasi campione come campione di riferimento per la correzione batch (ad esempio, wild-type, replica 1).
- Calcola la somma dei conteggi ionici per tutti i metaboliti all'interno del campione di riferimento. Ripeti questo calcolo per tutti i campioni.
- Dividere il conteggio totale degli ioni di ogni campione per il totale degli ioni del campione di riferimento per generare un rapporto.
- Dividere il conteggio di ioni per ogni metabolita all'interno di un campione per il rapporto campione/riferimento per ottenere un conteggio ionico corretto per loti per ciascun metabolito.
5. Normalizzazione dei peptidi
- Dividere i valori di conteggio ionico corretti per lotti per ogni campione ottenuto nel passo 4 per la concentrazione peptidica determinata con il test BCA nel passo 2 per ottenere un valore normalizzato per ciascun metabolito.
NOTA: I conteggi ionici normalizzati e corretti per batch per ogni metabolita ottenuto nel passo 5.1 possono essere confrontati direttamente tra ceppi e sottoposti ad analisi statistica (ad esempio, un test U di Mann-Whitney). In alternativa, un metabolita noto per essere invariato sia dal trattamento che dal background genetico può essere usato come normalizzatore per rilevare cambiamenti dovuti alla decomposizione metabolitica. L'inclusione di una quantità nota di L-norvalina o acido glutarico nel tampone di estrazione può essere utilizzata per correggere la perdita durante la lavorazione del campione.