Monitoraggio della crescita batterica in formulazioni di mezzi distinti con un microbioreattore automatizzato

Abstract

Fonte: Hemmerich, J., et al. Protocollo per l'ottimizzazione della produzione di proteine eterologhe utilizzando la tecnologia automatizzata dei microbioreattori. J. Vis. Esp. (2017).

Questo video dimostra l'uso di un microbioretore automatizzato per monitorare la crescita batterica e la secrezione di proteine fluorescenti in risposta a diverse formulazioni di mezzi. Un batterio geneticamente modificato che esprime una proteina fluorescente secretoria viene coltivato sotto selezione antibiotica e inoculato in pozzi a variazione di nutrienti. Misurazioni ottiche in tempo reale della densità e fluorescenza cellulare consentono un'analisi comparativa della produzione proteica tra diverse condizioni di crescita.

Protocollo

1. Preparazione dei materiali e procedure di definizione
NOTA: Si consiglia di definire e fissare i metodi sperimentali a un livello dettagliato. Questa standardizzazione garantisce che risultati diversi possano essere ricondotti alla variabilità biologica intrinseca o a composizioni di mezzo differenti.
NOTA: Soluzioni per il stock media: Prepara soluzioni individuali per tutti i componenti mediatico investigati. Prepara scorte altamente concentrate per permettere la diluizione di diversi volumi per tutti i componenti. Ciò significa che, dopo aver combinato tutte le soluzioni stock al loro volume massimo secondo il piano di progettazione, questo non può superare il volume finale di coltivazione, cfr. paragrafo "Generation of medium stock solution pipetting list" passo 1.3.3. Se l'aggiunta di una soluzione altamente concentrata comporta un volume di aggiunta molto basso, ad esempio < 1/100 del volume finale di coltivazione, si diluisce di conseguenza la soluzione stock. Ad esempio, in questo studio, un volume di pipettura inferiore a 10 μL è stato definito inviabile. Tipicamente, le soluzioni di oligo-elementi sono concentrate fino a 1.000 volte rispetto alla concentrazione standard finale nel mezzo. È vantaggioso concentrare i componenti del mezzo come multipli (X-fold) rispetto alle concentrazioni nella ricetta di riferimento. In questo modo si evitano volumi di pipettura irrealizzabili di decimali frazionari. Ricette dettagliate per tutte le soluzioni stock del mezzo CgXII sono fornite nel documento supplementare.

1. Banca di celle funzionanti (WCB)
Nota: Per ogni esperimento di crescita viene utilizzato un aliquota WCB. Se sono necessari più aliquote, utilizzare un mezzo per infusione cardiaca cerebrale (BHI) da 100 mL in fiaschette di frullate da 1.000 mL o inoculare più fiaschette, che vengono raccolte prima dell'aggiunta della soluzione di glicerolo.

Prepara colonie singole del ceppo di espressione ricombinante C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 su piastre di agar (37 g/L di polvere BHI, 20 g/L di agar, 25 mg/L di kanamicina). Il materiale di corazzatura può provenire sia da una trasformazione fresca sia da un'aliquota criopreservata. Incubare a 30 °C fino alla comparsa di colonie singole; Di solito questo richiede uno o due giorni.
Inoculare una fiaschetta shaker (medium BHI da 50 mL con 25 mg/L di kanamicina, fiaschetta con 500 mL con fiaschetta a distanza, 250 rpm, diametro di agitazione di 25 mm, 30 °C) con materiale della colonia e incubare durante la notte (circa 16 ore).
Combinare un volume della sospensione cellulare risultante con un volume di soluzione di glicerolo sterile da 500 g/L e distribuire 2 mL di aliquote in fiale sterili di crioconservazione. Conserva a -80 °C.

2. Protocollo di coltivazione MBR
Nota: Per il sistema BioLector MBR impiegato in questo studio, la luce diffusa (biomassa) e la fluorescenza GFP sono misurazioni di intensità, che richiedono un certo valore di guadagno assegnato. Più alto è il guadagno, più alto è amplificato il segnale ottico; Ecco anche perché la luce diffusa e la fluorescenza sono misurate in unità arbitrarie (U.A.). Determinare valori di guadagno adeguati per la rilevazione di biomassa e GFP negli esperimenti preliminari, insieme a una frequenza di scuotimento e un volume di riempimento adeguati per evitare limitazioni di ossigeno a concentrazioni di biomassa più elevate nelle fasi successive del processo. Le condizioni di coltivazione impiegate ("piastre fioriali", cioè MTP a forma di fiore a 48 pozzi, frequenza di scuotimento di 1.200 rpm, volume di riempimento di 1.000 μL, 10 g/L di glucosio come principale fonte di carbonio) garantivano coltivazioni a ossigeno illimitato. Per velocità massime di trasferimento di ossigeno derivanti da altre combinazioni di volumi di riempimento e frequenze di scuotimento nei MTP a 48 pozzi a forma di fiore, sono disponibili schede tecniche dal fornitore. Inoltre, possono verificarsi difetti di crescita nelle singole colture a causa di basse quantità di substrati secondari (ad esempio, azoto, oligoelementi). Pertanto, controlla le concentrazioni di biomassa al termine della coltivazione. In questo studio non sono stati osservati tali effetti di crescita.

Definire il protocollo di coltivazione per il sistema MBR ("BioLector") come segue:
Set di filtri 1: Biomassa, guadagno 14. Filtro 2: pH, guadagno preimpostato. Set di filtri 3: pO2, guadagno preimpostato. 4: GFP, guadagno 80.
Frequenza di scuotimento: 1.200 giri/min.
Temperatura: 30 °C.
Tempo di ciclo: 15 min.
Tempo di esperimento: manuale (La coltivazione non si fermerà automaticamente).

3. Generazione di una lista di pipetting per soluzione di materiale medio
Nota: Quasi ogni sistema robotico per la movimentazione dei liquidi è in grado di leggere le azioni di pipettaggio da file esterni. Fondamentalmente, l'informazione minima necessaria è il volume e la posizione di trasferimento della sorgente del reagente, così come la destinazione di ciascuno rappresentata da una posizione di laboratorio sul piano robotico e da una cavità specifica all'interno del materiale di laboratorio. Tuttavia, devono essere considerate sintassi diverse per diversi sistemi di gestione dei liquidi. La Figura 1 mostra un esempio di struttura di file per il sistema di pipetting impiegato in questo studio.

1. Quattro tipi di soluzioni per stock vengono pipettate in ciascun pozzo di coltivazione:

Soluzioni stock di componenti di media varie ("Variazioni di Stock").
Acqua per compensare i diversi volumi cumulativi delle scorte sopra menzionate.
Una soluzione stock ("Stock Resto") che contiene tutti i componenti fissi. Questa soluzione di stocco può essere composta da scorte contenenti i diversi componenti che sono, ad esempio, conservati a temperature diverse o sterilizzati con metodi differenti.
Inoculum, che dovrebbe essere aggiunto come ultimo componente e messo sul tavolo da lavoro poco prima dell'aggiunta per evitare che le cellule si sedimentino.

2. Per ogni pozzo di coltivazione, calcolare i volumi da trasferire per tutti i componenti del mezzo secondo se:

Il volume da aggiungere per certe azioni di variazione può essere zero, cioè quando questo componente specifico viene omesso.

3. Rivedere tutti i volumi calcolati Vi per ottenere numeri adeguati. Gli incrementi di volume di pipet nei passi di volume non dovrebbero essere troppo piccoli. Se necessario, regolare le concentrazioni di azioni di variazione. Ad esempio, il volume minimo di pipettura qui era definito come 10 μL, e l'incremento minimo era definito come 5 μL. In generale, questi volumi dovrebbero essere definiti in base alla precisione e alla precisione determinate sperimentalmente per la stazione di gestione dei liquidi utilizzata.

4. Calcolare il volume del Stock di Riposo contenente i componenti fissi per tutti i pozzi come segue:

dove viene utilizzato il volume massimo cumulativo di Variazione Stock . Di conseguenza, calcola le concentrazioni richieste dei componenti fissi nel Stock di Riposo come segue:

Prepara il resto delle scorte di conseguenza.

5. Per ogni pozzo di coltivazione, calcolare il volume d'acqua da aggiungere come segue:

6. Per ogni pozzo di coltivazione, elencare tutti i volumi da aggiungere nel seguente ordine di aggiunta: V_H2O, V_RestStock, V_i,_{V Inok}. Formatta la lista di pipettura secondo le specifiche della stazione di trattamento dei liquidi, come mostrato ad esempio nella Figura 1.

2. Coltivazione dei semi, preparazione automatica dei media e inizio della cultura principale

Crea un protocollo per il robot per la gestione dei liquidi. Vedi la Figura 2 e la Figura 3 per un protocollo di esempio per un sistema "Janus", implementato nel corrispondente software "WinPREP". Il protocollo dovrebbe considerare i seguenti aspetti:

1. Includere una durata sufficiente di alloggiamento sterile prima della preparazione dei media.

2. Includere una pulizia e un lavaggio iniziali e eccessivi di tutte le punte e tubi per la pipetta.

3. Scegliere contenitori di laboratorio appropriati per le soluzioni di stock. Qui, piastre di pozzo profondo con 12 colonne sono adatte per lo stoccaggio di Variazioni Stock, poiché tutte e otto le punte di pipetting possono immergersi in una disposizione parallela nelle colonne del pozzo. Questo accelera notevolmente la preparazione dei media. Se come serbatoi vengono utilizzati tubi reagenti da 15 mL o 50 mL, solo una punta di pipetaggio può immergersi contemporaneamente. Per altri materiali come acqua e Stock di Riposo, si usano abbevutoare da 100 mL, poiché queste soluzioni di stock richiedono volumi complessivi maggiori.

4. Fornire un volume totale sufficiente per ogni soluzione stock per compensare i volumi di scarto, le offset di pipetting in altezza, ecc.

5. Inserire un prompt utente prima della fase di inoculazione, assicurandosi che questo passaggio venga eseguito immediatamente prima della procedura di coltura dei semi.

Prepara tutte le soluzioni di stocco in modo sterile e conserva fino all'uso, in contenitori appropriati, ad esempio provette sterili da 15 mL e 50 mL.
Sterilizza le piastre profonde per la conservazione della soluzione di stoccaggio su un tavolo da lavoro, ad esempio pulendo con etanolo al 70% e asciugando successivamente in una cappa a flusso laminare.
Inizia la coltura dei semi inoculando un mezzo BHI da 50 mL contenente 25 mg/L di kanamicina con un'aliquota del WCB. Prima della coltivazione del MBR, preparare un inoculo fresco e vitale proveniente da colture di semi in crescita esponenziale in quantità sufficiente.
Posiziona tutta la stoviga necessaria sul tavolo robotico e versa le soluzioni di stocco nell'attrezzatura corrispondente.
Avviare il flusso di lavoro robotico per la preparazione dei substrati, così che l'ultimo passaggio (l'inoculazione) venga raggiunto in tempo con l'inizio della coltura dei semi. Il tempo totale di esecuzione del flusso di lavoro robotico deve essere valutato in anticipo. Qui, la durata totale era di circa 1,5 ora.
Campionare la coltura del seme dopo circa 2 ore, poi ogni ora, per monitorare la crescita tramite densità ottica (OD₆₀₀). Dopo circa 5 ore, la coltura raggiunge 3-4 OD₆₀₀ ed è utilizzata per inoculare le colture principali.
Posizionare la coltura dei semi sul tavolo di lavoro del maneggiatore di liquidi e continuare il protocollo di preparazione del materiale. Coltivazione delle foche MTP dopo l'inoculazione.
Inserisci il MTP sigillato nella coltivazione del dispositivo BioLector e avvia il protocollo di coltivazione predefinito.
Smaltire le soluzioni rimanenti di stock, secondo le normative di biosicurezza se necessario, e seminare la coltura dal tavolo robotico. Pulisci i materiali di laboratorio riutilizzabili e avvia il protocollo di decontaminazione per la maneggiazione di liquidi.

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Risultati

Figura 1: Screenshot dalla lista di pipetting del volume per l'analisi della sensibilità. Le voci nella prima colonna assegnano un identificatore unico a tutti i volumi di una riga; questo identificatore è il numero del pozzo MTP della colt...