Crioconservazione a lungo termine di ceppi cianobatterici utilizzando glicerolo o dimetilsolfosidismo

Abstract

Fonte: Lea-Smith, D. J., et al. Generazione di mutanti marcati e senza marcatori in specie cianobatteriche modello. J. Vis. Esp. (2016)

Questo video dimostra la crioconservazione dei ceppi cianobatterici combinando sospensioni cellulari concentrate con glicerolo o DMSO e conservandoli a basse temperature, consentendo il mantenimento a lungo termine di colture vitali per la fotosintesi e studi genetici.

Protocollo

1. Preparazione dei Media Culturali

1. Prepara il BG11 medio
   1. Prepara soluzioni di stocco di 100x BG11, elementi in tracce e calcio di ferro (Tabella 1).
   2. Preparare soluzioni separate di stock fosfatico, carbonato di sodio (Na₂CO₃) stock N-[Tris(idrossimetil)metilo] -2-aminoetanolosulfonico (TES) e bicarbonato di sodio (_{NaHCO 3}) (Tabella 1).
   3. Autoclave le scorte di fosfato e Na₂CO₃ . Sterilizza il tampone TES e il_{NaHCO 3} con filtri da 0,2 μm.
   4. Prepara BG11 combinando 976 ml d'acqua, 10 ml di BG11 100x, 1 ml di oligoelementi e 1 ml di ferro e autoclave la soluzione. Dopo che questa soluzione si è raffreddata a temperatura ambiente, aggiungi 1 ml di brodo di fosfato, 1 ml di brodo Na₂CO₃ e 10 ml di_{NaHCO 3}.
   5. Per il mezzo solido BG11, aggiungi 15 g di agar e 700 ml d'acqua in una fiaschetta. Alla seconda fiaschetta, aggiungi 3 g di tiosolfato di sodio (Na₂S₂O₃), 226 ml d'acqua, 10 ml di 100x BG11, 1 ml di oligoelementi e 1 ml di calcio di ferro. Autoclave entrambe le soluzioni. Dopo che queste soluzioni si sono raffreddate a temperatura ambiente, si combinano e si aggiungono 1 ml di brodo di fosfato, 1 ml di brodo di Na₂CO₃ , 10 ml di tampone TES e 10 ml di_{NaHCO 3}.
      NOTA: Le soluzioni vengono preparate separatamente per evitare la precipitazione di alcuni sali.
2. Per la selezione del saccarosio, prepara una soluzione al 50% (p/v) di saccarosio. Filtrare sterilizza la soluzione con filtri da 0,2 μm e aggiungerlo a BG11 (100 ml di saccarosio al 50% a 900 ml di BG11) per produrre piastre di saccarosio al BG11/5%.
   NOTA: Non aggiungere NaHCO₃ alle piastre di agar di saccarosio BG11/5%. Aggiungi Na₂CO₃ come al solito.
3. Per la coltivazione di Synechococcus, aggiungere 10 ml di 1 M 4-(2-idrossietil)piperazina-1-etanosolfonico, N-(2-idrossietil)piperazina-N′-(2-etanosulfonico) (HEPES) e 1 ml di vitamina B12 (Tabella 1) a 1 L di mezzo BG11.
   NOTA: La trasformazione dei ceppi coltivati in mezzi BG11 commercialmente disponibili è significativamente meno efficiente rispetto alle ricette per i mezzi BG11 descritte qui e quindi non è raccomandata.

2. Conservazione a lungo termine delle ceppe

1. Prepara una nuova coltura del ceppo inoculando un anello pieno di cellule in 30-50 ml di mezzo BG11. Coltiva la coltura per 3-4 giorni fino a OD_750nm = 0,4-0,7.
2. Lava le cellule una volta con BG11 e risospendi in ~2 ml di BG11.
3. Aggiungi 0,8 ml di cellule concentrate in un tubo. Poi aggiungi 0,2 ml di glicerolo sterilizzato all'80% con filtro.
4. Opzionale: Aggiungi 0,93 ml di cellule concentrate in un altro tubo. Aggiungi 0,07 ml di DMSO a questo tube.
   CAUTELA: Il DMSO è tossico e dovrebbe essere gestito con la protezione adeguata.
5. Conserva entrambi i tubi a -80 °C. Per rianimare i ceppi, rimuovi il tubo e raschia via alcune cellule con uno stuzzicadenti smussato su una piastra di agar senza antibiotici. Esci normalmente usando un anello sterile.

Tabella 1: Soluzioni utilizzate in questo studio

Ricette per la soluzione a base
Chimico	Importo (g)
100x BG11 (per L)
NaNO 3	149.6
MgSO4,7H 2O	7.49
CaCl2.2H 2O	3.6
Acido citrico	0.6
Aggiungi 1,12 ml 0,25 M Na2EDTA, pH 8,0
0,25 M Na2EDTA, pH 8,0 (per 100 ml)
Na2EDTA	9.3
Elementi traccia (per 100 ml)
H3BO3	0.286
MnCl2.4H 2O	0.181
ZnSO4.7H 2O	0.022
Na2MoO 4,2H 2O	0.039
CuSO4.5H 2O	0.008
Co(NO3)2.6H 2O	0.005
Brodo di ferro (per 100 ml)
Citrato di ammonio ferrico	1.11
Serbatoio fosfatico (per 100 ml)
K2HPO4	3.05
Na2CO3 stock (per 100 ml)
Na2CO3	2
TES buffer, pH 8,2 (per 100 ml)
TES	22.9
NaHCO 3 stock (per 100 ml)
NaHCO3	8.4
HEPES, pH 8,2 (per 500 ml)
HEPES	119.15
Vitamina B12 (per 50 ml)
Cianocobalamina	0.02
Medium Luria Bertani (Per 500 ml)
Brodo Luria Bertani	12.5
1 MMgCl 2 (per 100 ml)
MgCl 2,6H 2O	20.33
Soluzione A (per 200 ml)
MnCl2.4H 2O	0.395
CaCl2.2H 2O	1.47
2-(N-Morfolino)acido etanosolfonico idratato, 4-morfolineanosulfonico acido (MES)	0.4265
Soluzione A + glicerolo
Soluzione A da 10 ml
1,5 ml glicerolo

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
Acido citrico	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Pescatore	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Citrato di ammonio ferrico	Sigma	F5879
K₂HPO	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Pescatore	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Pescatore	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cianocobalamina	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Saccarosio	Pescatore	SUC001
Pianta di Petri 90 mm con tripla ventilazione	Greiner	633185
Filtri da 0,2 μm	Sartorius	16534
Fiaschette coniche da 100 ml	Pirex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
Phusion ad alta fedeltà DNA polimerasi	Phusion	F-530
Agarosio	Melford	MB1200
Kit per la purificazione del DNA	MoBio	12100-300
Endonucleasi di restrizione	NEB
Ligasi T4	Thermo Scientific	EL0011
Brodo Luria Bertani	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Kanamicina solfato	Sigma	60615
Ampicillina	Sigma	A9518
Kit di miniprep plasmidi GeneJET	Thermo Scientific	K0503
Tubo a fondo rotondo da 14 ml	BD Falcon	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polimerasi	Promega	M7805
Perle di vetro da 425-600 μm	Sigma	G8772
Glicerolo	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Lampadine fluorescenti	Gro-Lux	69
Fotobioreattore multitron HT	Infors