Modellazione della fagocitosi mediata dal complemento utilizzando globuli rossi opsonizzati in vitro

Abstract

Fonte: Nagre, N., et al. Macrofagi alveolare, fagocitosi e eliminazione dei batteri nei topi. J. Vis. Esp. (2019).

Questo video dimostra la valutazione della fagocitosi mediata dai recettori del complemento utilizzando globuli rossi di pecora opsonizzati con IgM e complemento, seguita dalla loro acquisizione da parte dei macrofagi del topo. L'entità della fagocitosi viene quantificata midendo un prodotto cromogenico blu formato tramite ossidazione catalizzata dall'emoglobina del diaminofluorene.

Protocol

1. Fagocitosi mediata da FcγR e CR

1. Per l'opsonizzazione, incubare 2 x^{10 globuli rossi di 8} globuli rossi di pecora (SRBC) con 50 μL di anti-SRBC-IgM di coniglio o 50 μL di anti-SRBC-IgG per 30 minuti a temperatura ambiente.
2. Incubare SRBC opsonizzati con IgM con 50 μL di siero umano carente di C5 (C5D) per 30 minuti a 37 °C per fissare i frammenti di complemento C3b e C3bi sulle SRBC rivestite di IgM.
3. Semina cellule macrofaghe murine (cellule MH-S) (10.000 cellule/pozzo) in una piastra da 96 pozzi e incuba durante la notte per ottenere una confluenza del ~70%. Aggiungi 100 μL di 1 x 10 SRBC opsonizzate da^{10 7}/mL in ciascun pozzo di cellule MH-S e incuba per 1 ora a 37 °C. Lava rapidamente le SRBC non legate (~1 min) con 100 μL di tampone di lisi cloruro di ammonio-potassio (ACK).
4. Lisare le cellule con SDS allo 0,1% e aggiungere 50 μL di 2,7-diaminofluorene (DAF) contenente il 3% di perossido di idrogeno e 6 urea M. Misurare l'assorbanza della formazione blu di fluore catalizzata dall'emoglobina a 620 nm.
5. Determinare il numero di SRBC utilizzando una curva standard a valori di assorbenza di 620 nm con un numero noto di SRBC. Analogamente, processano cellule MH-S incubate con SRBC non opsonizzate da utilizzare come controlli negativi.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,7-diaminofluorene (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Grado di Biologia Molecolare
70% etanolo	Decon Labs Inc.	18C27 B	Grado analitico
Piastra a 96 pozzi	Corning	3603	Grado in Biologia Cellulare
Buffer di lisi ACK	Life Technologies	A10492	Grado di Biologia Molecolare
Siero carente di C5	Sigma-Aldrich	C1163	Reagente biochimico
Centrifuga	Labnet International	C0160-R
Citocentrifuga Cytospin 4	Thermofisher Scientific	A78300101 Numero 11
Mezzi di coltura cellulare DMEM	Gibco	11995-065	Grado in Biologia Cellulare
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Grado in Biologia Cellulare
Citometro di flusso	BD in Biologia	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Pinza	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Adatto per la dissezione di animali da laboratorio
Piatto con fondo di vetro	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Grado in Biologia Cellulare
Siringa ad alta pressione	Penn-Century	FMJ-250	Adatto all'uso con animali da laboratorio
Omogeneizzatore	Omni International	TH-01
Perossido di idrogeno	Sigma-Aldrich	H1009	Grado analitico
Microscopio a fluorescenza invertita	Olympus	IX73
MicroSpray Aerosolizzatore	Penn-Century	IA-1C	Adatto all'uso con animali da laboratorio
Paraformaldeide	Sigma-Aldrich	P6148	Grado reagente
PBS	Gibco	20012-027	Grado in Biologia Cellulare
coniglio anti-SRBC-IgG	MP Biomedici	55806	Adatto per immuno-analisi
coniglio anti-SRBC-IgM	Laboratori Cedarline	CL9000-M	Adatto per immuno-analisi
Forbici	Miltex	5-2	Adatto per la dissezione di animali da laboratorio
globuli rossi di pecora (SRBC)	MP Biomedici	55876	SRBC lavati e conservati