Imaging della localizzazione batterica e dell'interazione ospite nel tessuto polmonare umano

Abstract

Fonte: Mills, B., et al., Screening ottico di nuove sonde specifiche per batteri su tessuto polmonare umano ex vivo tramite endomicroscopia laser confocale. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video dimostra l'imaging in tempo reale di Staphylococcus aureus marcato fluorescentmente nel tessuto in sospensione e nei polmoni utilizzando la microscopia a fluorescenza confocale fibrata.

Protocol

1. Raccolta dati con endomicroscopia laser confocale (CLE)
   1. Dopo la configurazione, si aprirà una finestra per selezionare la posizione di archiviazione e il prefisso file. Seleziona la cartella desiderata per l'archiviazione dei dati e nomina il prefisso di conseguenza.
   2. Posiziona i pedali in modo che l'operatore possa facilmente raggiungerli. Pedale sinistro: laser acceso/spento; pedale centrale: pausa; Pedale destro: registra/ferma.
      NOTA: I comandi laser sono accessibili anche tramite i comandi sullo schermo.
   3. Clicca su 'start' sullo schermo oppure premi il pedale sinistro per accendere il laser. Questo avvierà l'acquisizione e l'ottenimento delle immagini utilizzando il 100% di potenza laser e un frame rate di 12 fotogrammi/s (impostazioni predefinite).
      NOTA: Per altre applicazioni, queste impostazioni possono essere modificate sullo schermo se necessario, a seconda del tipo di campione.
   4. Immagini ciascuno dei campioni di sospensione batterica.
      1. Inserire l'estremità distale della fibra di imaging FCFM (microscopia a fluorescenza confocale con fibre) e muovere lentamente la fibra attraverso la sospensione per esaminare il campione.
      2. Registra video di qualsiasi lunghezza (fino a 10 minuti) premendo il pedale destro o selezionando i controlli di registrazione sullo schermo, mentre la fibra si muove lentamente intorno al campione.
      3. Pulire l'estremità distale della fibra di imaging FCFM con 8% di H_{, 2O2} e i tessuti per la pulizia del cristallino tra i campioni. ​
         NOTA: Durate video tipiche di 10-30 secondi sono sufficienti per l'imaging in vitro .
   5. Immagini ciascuno dei campioni di tessuto polmonare.
      1. Inserire l'estremità distale della fibra di imaging FCFM nel campione, assicurando un contatto diretto tra l'estremità della fibra e il tessuto. Muovi delicatamente l'estremità della fibra di imaging per esaminare il campione.
         NOTA: Allontanare l'estremità della fibra dal tessuto rimuoverà il tessuto dal piano focale; tuttavia, questo può essere usato per visualizzare batteri etichettati che non sono aderiti al tessuto.
      2. Registra video di qualsiasi lunghezza (fino a 10 minuti) premendo il pedale destro o selezionando i controlli di registrazione sullo schermo, mentre la fibra si muove lentamente intorno al campione.
         NOTA: Tipicamente, durate video di 30 secondi sono sufficienti per l'imaging ex vivo su tessuto.
      3. Pulisci l'estremità distale della fibra di imaging FCFM con tessuti per la pulizia delle lenti e 8% di_H2O2 tra un campione e l'altro.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-14 Microfuge	SciQuip	90616	Microcentrifuga da banco piccola
Piastra a 96 pozzi	Corning	3370	Piastra di analisi
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Colorante fluorescente commerciale
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Dispositivo di endomicroscopia laser confocale
Cletop-S	Cletop	14110601	Pulitore per fibre
Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	Tubo microfuge da 1,5 mL
Soluzione salina tamponata con fosfato di gibco	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - materiale di lavaggio
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Software di raccolta e elaborazione dati per il sistema di ricerca CellVizio 488 nm
AlveoFlex da ricerca non standard 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Fibra di microscopia a fluorescenza confocale fibrata
Kit Quanti 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Kit di calibrazione per il sistema CellVizio 488
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Ceppo batterico utilizzato in questo studio
Cuvette semi-micro-spettrofotometrica	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Per la spettrofotometria
Comfort del termomixer	Eppendorf	41102422	Riscaldatore da banco con scuotimento