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R: cateterizzazione chirurgica di circolazione venosa e arteriosa
Parte 1: catetere arterioso e venoso Preparazione
- Tagliare 15 cm di PE-50 (diametro interno di 0,58 millimetri (0,023 ") x un diametro esterno di 0,965 millimetri (0,038"). Tagliare una sezione di tubo silastic 1 millimetro (0,76 mm (0.030 ") di diametro interno x 1,65 millimetri (0,065 ") di diametro esterno) per l'utilizzo come contenimento tallone. Il contenimento tallone impedisce al ratto di tirare fuori il catetere una volta che è a posto.
- Inserire la punta delle micro dissettore nel lume del cordone frenare dolcemente e tenere le punte della pinza a parte per allungare l'apertura più ampio. Utilizzando un altro paio di micro dissettore, far scorrere il tubo silastic nel lume del contenimento tallone. Fissarlo con colla adesiva forte (Loctite Super Glue). Il tallone deve essere piatto intorno al catetere. Lasciare catetere a secco (24 ore).
- Per un ratto 300 grammi, la linea arteria è ~ 2,7 centimetri dal tallone frenare mentre la linea giugulare è ~ 3,2 centimetri. Lunghezze catetere dalla frenanti sono regolati da 0,5 centimetri per ogni aumento di 100g di peso corporeo. Non smusso gli spigoli del catetere come questa puntura può nave nel corso di inserimento.
- Immediatamente prima dell'intervento, riempire le linee con soluzione fisiologica eparinata (10U/ml), sigillare entrambe le estremità con un tappo di tubi in acciaio inox e il luogo in etanolo (70%) per sterilizzare. Aria secca prima dell'inserimento.
Parte 2: Preparazione Chirurgica
- Procedure sono state approvate dalla University of Animal Care Calgary e Usa Comitato e rispettare theCanadian Association for Animal Science Laboratory linee guida per la sperimentazione. Le procedure descritte di seguito sono stati eseguiti su adulti, maschi Sprague-Dawley (~ 300g). Tutte le procedure vengono eseguite sotto isoflurano, anche se è possibile utilizzare anestetici iniettabili. Tutte le procedure chirurgiche vengono eseguite garantendo tecniche asettiche. Attrezzature chirurgiche, bicchieri e soluzione salina eparinata sono sterilizzati in autoclave. Guanti chirurgici, siringhe e applicatori di cotone sterilizzati punta vengono acquistati dal fornitore.
- Pesare il ratto e registrare il risultato. Il peso sarà importante nel periodo post-chirurgico di monitoraggio degli animali. Solo gli animali che per ritrovare il peso pre-intervento i livelli dovrebbero essere utilizzati per la sperimentazione. Anestetizzare ratto (3% isoflurano) in una scatola di anestetico. Tenere il ratto a ~ 2% isoflurano durante l'intervento chirurgico utilizzando un cono. La chirurgia deve essere condotta in una zona disinfettata che promuove asepsi.
- Preparare l'animale dalla depilazione del sito chirurgico (collo e scapole). Un tagliatore di capelli di piccole dimensioni o depilatori chimici possono essere utilizzati. Eseguire questa procedura in una zona separata dalla quale l'intervento deve essere effettuata.
- Sicuro animale tavolo operatorio. Garantire animale è completamente anestetizzato controllando la presenza di piede / occhi riflessi. Preparare i siti chirurgici con un disinfettante appropriato pelle (70% etanolo seguita da betadine scrub seguito da 70% etanolo).
Parte 3: Chirurgia
- Fai la piccola incisione verticale 1 centimetro linea mediana superiore allo sterno (Pick up della pelle longitudinalmente lungo l'asse mediano con una pinza e taglio con forbici o bisturi).
- Blunt sezionare con micro dissettore per esporre il muscolo sternocleidomastoideo sinistro. Riflettere questo muscolo per esporre circa 1 cm della arteria carotide sinistra. Usa micro dissettore sotto carotide per tenere l'arteria in posizione. Delicatamente stuzzicare fuori del tessuto connettivo dalla carotide. E 'importante isolare il nervo vago dalla arteria senza danneggiare l'arteria e il nervo. Isolare l'arteria poi legare la fine cefalica con sutura in seta 4-0 (questo sarà usato per manipolare l'arteria carotide durante l'intervento chirurgico). Nota: 4-0 punti di sutura devono essere sterilizzati con etanolo al 70% prima dell'uso.
- Bloccare il vaso con seghettato, micro dissezione pinze. Puntura alla fine legatura con un calibro 21 VENOJECT Multi-Sample adattatore Luer. Togliere il tappo tubi in acciaio inox e inserire con cautela catetere con l'ausilio di un introduttore catetere sterile ammetterlo nell'arteria. Assicurare il catetere è sicuro con le pinze, parzialmente rilascio micro dissettore bloccaggio l'arteria e continuare a inserire il catetere per il tallone. A questo punto, la punta del catetere deve essere in aortico. Fare attenzione a non rilasciare catetere, la pressione del vaso lo costringerà ad uscire.
- Legare due punti di sutura 4-0 saldamente sotto tallone e uno sopra e confermare che il catetere campione. Lavare il catetere con soluzione fisiologica eparinata 10U/ml. Re-inserire l'estremità esterna del catetere con un tappo in acciaio tubi di acciaio.
- Utilizzando la stessa incisione, smussato sezionare per esporre destra vena giugulare esterna. Isolare accuratamente e legare la fine cefalica con sutura di seta. Puntura della vena con un calibro 21 VENOJECT Multi-Sample adattatore Luer. Togliere il tappo tubi in acciaio inox e inserire catetere con una soluzione sterile catheter introduttore al tallone e cravatta due punti di sutura sotto il tallone. Tie una sutura terza sopra tallone e confermare che i campioni. A filo con la linea venosa 10U/mL eparinizzato salina. Re-inserire l'estremità del catetere esterno con spina in acciaio tubi di acciaio.
- Tunnel 14-gauge ottuso sotto la pelle e fare incisione nella parte posteriore tra le scapole. Infilare il catetere attraverso l'ago di esteriorizzare loro nella parte posteriore del ratto. Circa 4cm di linea è visibile. 0,5 centimetri di taglio Tygon S-50-HL Tubazione medica, si svolge intorno entrambi i cateteri esteriorizzato e fissare con un nastro come richiesto (per la vena blu, rosso per le arterie). Retest cateteri per garantire la pervietà, lavare e riempire con soluzione fisiologica eparinata 150U/ml per prevenire la coagulazione.
- Chiudere tutte le incisioni con 3-0 sutura seta. Luogo ratto prona, in pre-riscaldato, gabbia pulita con il cibo sul fondo della gabbia.
B: Cura postoperatoria
Parte 1: Immediato cure post-operatorie e di monitoraggio
- Una volta che il ratto riacquista piena capacità ambulatoriale e la vigilanza restituire il ratto di stabulazione degli animali.
- Lasciare che il ratto di recuperare per 3-5 giorni.
- Daily Monitor per le infezioni, dolore e variazioni di peso. L'infezione può essere problematica se scarico da siti incisione, letargia generale e / o dolore si osserva. Il dolore è indicato dalla postura ricurva, pelo arruffato schiena e l'assenza di comportamenti ambulatoriali e / o mangiare. Una perdita di peso può essere vissuto immediatamente dopo l'intervento fino a tre giorni post-intervento chirurgico, tuttavia, il peso dovrebbe stabilizzarsi e / o aumentare entro il 10% del pre-chirurgica peso entro 5 giorni. Grave perdita di peso può indicare una infezione, ictus e / o dolore.
- Retest cateteri quotidianamente per garantire la pervietà.
Parte 2: Mantenimento pervietà del catetere
- Ogni giorno, durante il recupero post-operatorio, riempire 1ml Siringhe Suggerimento slip con 150U/ml soluzione salina eparinata e cappuccio con un ago da 22 gauge smussato. L'ago viene inserito nel ottuso 20cm di tubo in PE-50 con 23 tubi di attacco in acciaio inox calibro all'altra estremità.
- Rimuovere le bolle d'aria, ponendo fine con l'accoppiatore tubo superiore rispetto al resto della siringa da 1 ml e spingendo le bolle fuori dalla linea.
- Morsetto dalla linea arteriosa esternato dal ratto con hemostats appena sotto il tappo.
- Togliere il tappo del catetere d'acciaio con la seconda coppia di hemostats.
- Inserire l'accoppiatore tubo collegato alla siringa nella linea arteriosa e rilasciare il hemostats occludere il catetere arterioso esternalizzati.
- Aspirare il sangue arterioso del catetere nella siringa. Se il catetere non disegna facilmente può essere necessario spingere molto delicatamente in una piccola quantità di soluzione di flush mediante il catetere per spostare la punta del catetere nel caso sia incastrato contro il muro nave. Il catetere è stato completamente eliminato quando il sangue raggiunge la siringa.
- Bloccare il vicino PE-50 tubo alla siringa 1 ml e gettare la siringa. Sostituire con una nuova siringa piena di soluzione salina fresca 150U/ml eparinizzato. Sbloccare il tubo e tenendo la siringa nuova in posizione verticale, leggermente la siringa nuovo con un dito per rimuovere eventuali bolle d'aria nuova possibile verso l'alto e lontano dalla linea. Nota: Si deve essere garantita come bolle d'aria possono provocare un ictus.
- Iniettare la soluzione salina 150U/ml heparinzed finché la linea catetere sia limpida e priva di sangue.
- Morsetto dalla linea arteriosa esternato dal ratto con hemostats appena sotto l'attacco tubo. Rimuovere il connettore siringa dalla linea di catetere arterioso e sostituirlo con il tappo di tubi di acciaio inox.
- Rilasciare il hemostats occludere il catetere arterioso esternalizzati.
- Ripetere l'operazione per linea venosa. Tuttavia, a causa della bassa pressione venosa campionamento spesso non è possibile. Se la soluzione salina 150U/ml heparinzed può essere infusa con una resistenza minima è probabile che il catetere è ben posizionata nella vena.
C: iperinsulinemici-euglicemico morsetto
Parte 1: Morsetto di set-up e preparazione
- Pesare il ratto e registrare il peso. Questo sarà necessario per determinare i tassi di infusione di insulina e glucosio. Veloce il ratto per almeno 5 ore prima di sperimentare. In questo modo l'animale è in uno stato post-prandiale e l'apporto di glucosio da fonti alimentari è ridotto al minimo. Posizionare il topo in un piccolo contenitore / gabbia con biancheria da letto, che limita il movimento eccessivo. L'animale deve essere in grado di girarsi e lo sposo liberamente.
- Impostare le linee e le pompe di infusione come si vede nella figura 1. P50 lunghezze di tubazioni di collegamento sono le seguenti: siringa a Y connettore è da 8 cm, connettore a Y per ratto è 15 cm, linea arteriosa è 20cm, e la linea venosa è 10 cm di lunghezza. Rimuovere le spine in acciaio tubi di acciaio e filo linee giugulare e per assicurare l'infusione arteriosa e di campionamento rispettivamente con 10U/ml soluzione salina eparinata.
- Determinare l'insulina volume richiesto. Questo può variare a seconda del livello di insulina e il peso del topo. Qui, 4mU/kg/min viene somministrato ad una velocità di 2uL/min. Si tratta di una dose elevata fisiologico. Ove possibile, i tentativi dovrebbe essere fatto per limitare il volume di infusione. Insulina deve essere opportunamente diluita e possono essere somministrati in presenza di plasma. Una soluzione al 3% nel plasma di ratto in soluzione salina viene utilizzato per diluire l'insulina in questo laboratorio. L'insulina è HumulinR 100U/ml (Eli Lily), anche se altri l'insulina ad azione rapida può essere impiegato. Garantire l'insulina diluita è ben miscelati prima di mettere in infusione siringa.
- Preparare il 50% destrosio. Questo può essere inserito direttamente nella siringa sulla pompa di infusione. Segna pompa con 'glucosio' per evitare confusioni. Ricordatevi di garantire volumi sufficienti di insulina e glucosio per lo studio. Morsetti durano generalmente ~ 2h. Nel presente protocollo, siringhe da 3 ml sono utilizzati.
- Luogo glucosio e siringhe da insulina sul modello di Harvard Apparatus 11 Plus pompe siringa. Anticipo glucosio connettore a Y e la linea con un morsetto hemostat. Insulina anticipo per animali, morsetto linea con hemostat. Morsetto linee e permettere ratto di rilassarsi per 30 minuti prima di iniziare l'esperimento. NOTA: le guardie punta hemostat sono suggeriti al fine di evitare permanente crimpatura delle linee.
- Preparare centrifuga e EDTA rivestite tubi per la raccolta del plasma. Nel presente studio, i campioni di sangue supplementari saranno ottenute una volta che l'animale è bloccato.
Parte 2: protocollo sperimentale
- Un campione di insulina basale e campione dell'ematocrito devono essere acquisite. Campionamento ematocrito assicura il volume del sangue è mantenuto per tutto l'esperimento. In generale, i livelli di ematocrito non deve scendere oltre il 10% del valore iniziale.
- Ottenere un campione di glucosio al basale (One Touch Ultra, LifeScan, Inc.) e determinare il livello di glucosio nel sangue intero da bloccare. Qui, morsetto a euglicemia, o 5.0-5.5 mm (Figura 2). Dopo ogni campione di sangue, lavare la linea arteriosa con un piccolo volume di soluzione salina 10U/ml eparinato per prevenire la coagulazione. NOTA: Assicurarsi che nessun grumi o bolle d'aria sono in prima linea prima di infondere. Questi possono dare l'animale un colpo.
- Avviare l'infusione di insulina. Prendere glicemia a 5-10min intervalli, il monitoraggio della glicemia in ogni punto. Regolare la velocità di infusione del glucosio come richiesto fino ad uno stato stazionario è raggiunto. Questo processo è generalmente un processo di tentativi ed errori e può richiedere 30 minuti per> 2 ore. I livelli di glucosio necessario per mantenere la glicemia dipendono dal protocollo di sperimentazione, le specie e le condizioni presenti (Figura 2).
- Costante dei livelli di glucosio sono stato tre letture consecutive entro un range definito. Qui, tre letture in ~ 1 mM è considerato bloccato (ad esempio 4.8, 5.2, 5.6mm). Una volta allo stato stazionario è raggiunto, registrare la velocità di infusione glucosio tenuti a mantenere la glicemia per un periodo di 30 min. Durante questo periodo i campioni di sangue complementare sono disponibili. Come minimo, un secondo campione di insulina plasmatica e il campione ematocrito dovrebbe essere ottenuto.
- Una volta pinza è stata completata, gli animali possono essere utilizzati per ulteriori test o di eutanasia e tessuti raccolti per ulteriori analisi. A seconda che l'animale, le linee catetere può rimanere brevetto per 5-7 giorni.
D: iperinsulinemici-euglicemico (insulina) Risultati morsetto
Quando eseguito correttamente, la procedura di clamp valuta la costante sensibilità all'insulina stato del ratto. Nel presentare i dati ottenuti dal morsetto, è fondamentale per documentare i livelli di glucosio e la velocità di infusione glucosio. I livelli di glucosio stabile nel tempo un corso da un minimo di 30 minuti (Figura 3) sono indicativi di uno stato stazionario. Il glucosio è considerato stabile solo se il glucosio nel sangue intero sia mantenuta entro ~ 1 mm. Velocità di infusione glucosio mostrano i livelli di glucosio esogeno tenuti a mantenere la glicemia. Ove possibile, queste cifre devono essere visualizzati come un corso di tempo, piuttosto che singoli, valore medio (Figura 4).
Altre misure raccomandate da segnalare sono l'insulina plasmatica e dell'ematocrito. La determinazione della glicemia sia a digiuno e bloccato i livelli di insulina confermare che l'insulina è stato somministrato con successo e in grado di rilevare eventuali differenze di livello tra i gruppi di trattamento (Figura 5). Misure di ematocrito ottenere al basale e alla conclusione della pinza insulina vengono suggerite (Figura 6). Questo per garantire i livelli di ematocrito non rientrano più del 5% durante l'esperimento e le alterazioni che accompagnano in volume del sangue e il flusso non influenza lo smaltimento del glucosio.
Figura 1. Set-up sperimentale. La figura 1 mostra sfrenato, ratto cosciente durante la procedura di clamp. Cateteri permettere il prelievo di sangue e infusi senza manipolazione l'animale. Le pompe a sinistra contengono insulina e glucosio.
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Figura 2. Attesi dati durante la procedura di clamp. Per ottenere una pinza a livelli basali (euglicemia, 5mm), i livelli di glucosio esogeno (D50) sono manipolati fino a quando la linea di base o 'pinza' è raggiunto.
Figura 3. Attesi risultati di glucosio plasmatico della procedura di clamp. Quando l'animale è 'bloccato', la glicemia è relativamente stabile nel tempo e gruppi sperimentali.
Figura 4. Rappresentante tassi di glucosio infusione della procedura di clamp. La quantità di glucosio esogeno tenuti a mantenere euglicemia diverso. Questo è illustrato con un controllo (chow alimentato) e ricca di grassi nutrito (insulino-resistenti) animali. L'alta grassi animali nutriti richiede meno di glucosio infusa per mantenere la glicemia, soprattutto perché è insensibile all'insulina infusa.
Figura 5. Insulina plasmatica Rappresentante del ratto. L'insulina plasmatica durante il morsetto insulina deve essere superiore al digiuno, l'insulina plasmatica basale. In questo modo l'insulina è stato correttamente somministrato all'animale durante il morsetto insulina.
Figura 6. Segnalazione ematocrito. L'ematocrito basale e ematocrito dopo l'esperimento deve essere ottenuto e segnalati. Questo assicura livelli di ematocrito non rientrano più del 5% dei livelli basali che derivi dalla eccessivo prelievo di sangue arterioso.