Pulizia selettiva dei vermi della Caenorhabditis per l'arricchimento del microbiota intestinale

Abstract

Fonte: Morgan, E., et al. Pulizia selettiva dei nematodi selvatici Caenorhabditis per arricchire i batteri del microbioma intestinale. J. Vis. Esp. (2021)

Questo video mostra un protocollo per isolare batteri intestinali di interesse provenienti dai vermi selvatici di Caenorhabditis . I vermi vengono prima affamati e lavati per eliminare i batteri residui che si nutrono dalla superficie e dal lumen intestinale, preservando al contempo i microrganismi bersaglio. Dopo la pulizia della superficie e diversi passaggi di strisciamento, i vermi vengono dissezionati per estrarre intestini contenenti i batteri di interesse, che vengono poi raccolti e congelati per la conservazione.

Protocollo

1. Identificazione intestinale e PCR delle specie microbiche

1. Allevano gli animali a 20 °C per 3-4 giorni per permetterli di morire di fame e ridurre la quantità di batteri OP50-1 (ceppo Escherichia coli OP50-1). Aggiungi 5 mL di substrato M9 al piatto dei vermi affamati.

2. Utilizzando una pipetta e un bulbo di vetro sterile, si rimuovono i vermi M9+ dalla piastra e trasferili in un tubo centrifuga sterile da 15 mL.

3. Utilizzando una centrifuga clinica, centrifugare i vermi nel tubo a 1000 x g per 30 secondi a temperatura ambiente.

4. Utilizzando una pipetta sterile da 15 mL, rimuovere il surnatante dal tubo della centrifuga senza disturbare i vermi vivi sul fondo del tubo.

5. Aggiungere 10 mL di M9 + 0,05% Triton X-100 e incubare il tubo su un nutatore per 20 minuti per rimuovere i microbi esterni. Ripeti quattro volte per lavare i vermi.

6. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzando una punta sterile di pipetta, rimuovere il surnante senza disturbare il pellet sul fondo in 100 μL di soluzione.

7. Usando una punta sterile di pipetta, trasferisci M9 e i vermi su una piastra NGM non seminata e lascia asciugare la piastra mentre i vermi si muovono per 20 minuti per aiutare a rimuovere OP50-1 dalla cuticola e dall'intestino.

8. Aggiungere 250 μL di M9 alla piastra essiccata e utilizzare una pipetta di vetro per trasferire M9 + vermi su una nuova piastra NGM non seminata. Ancora una volta, lascia asciugare il piatto e lascia che i vermi si muovano per 20 minuti.

9. Aggiungere 250 μL di M9 alla piastra e trasferire 100 μL di M9+ a un vetro da orologio pulito.

10. Utilizzando due aghi sterili da 26 G, decapitare i nematodi tenendo il verme fermo con un ago e usando l'altro ago per tagliare il verme. Dopo la decapitazione, l'intestino (granulare) e la gonade (trasparente) dal corpo escono naturalmente dal corpo.

11. Taglia un pezzo dell'intestino esposto tenendo l'intestino con un ago e tagliandolo con l'altro.

NOTA: Se possibile, verificare che il microrganismo di interesse sia ancora presente negli intestini evertiti utilizzando microscopia Normarski, ibridazione fluorescente in situ (FISH) o immunoistochimica.

12. Trasferire un singolo intestino dissezionato in un tubo PCR da 0,5 mL contenente 10 μL di acqua sterile. Ripeti per un totale di almeno 5 tubi PCR (reazione a catena della polimerasi) contenenti intestini di diversi animali.

13. Congelare i tubi PCR a -80 °C per un minimo di 5 minuti. Rimuovi i tubi PCR dal congelatore e scongela i campioni.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
10% SDS	Invitrogen	AM9822
Ago BD PrecisionGlide - 26 G	Fisher Scientific	305115
KH₂PO₄	Fisher Scientific	P-286
NaCl	Fisher Scientific	S-671
NH₄Cl	Fisher Scientific	A-661
Streptomicina	Millipore-Sigma	S6501-50G
Tetraciclina	Millipore-Sigma	T7660-5G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151
Occhiali da orologio	VWR	470144-850