Ibridazione in situ fluorescente dei batteri intestinali nelle sezioni intestinali del topo

Abstract

Fonte: Ng, K. M., Tropini, C. Visualizzazione delle interazioni microbiota-ospite intestinale tramite ibridazione fluorescente in situ , colorazione con lectine e imaging. J. Vis. Esp. (2021).

Questo video dimostra la procedura di ibridazione fluorescente in situ (FISH) per colorare il microbiota intestinale all'interno del tessuto intestinale del topo ibridando sonde fluorescenti con rRNA batterico (acido ribosomico ribonucleico) e controcolorando le strutture dell'ospite per analisi microscopiche.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali appropriato

1. Colorazione batterica con FISH (ibridazione fluorescente in situ)
   1. Usa un bloccante liquido o una penna barriera idrofobica (PAP penn) per limitare l'area di espansione del liquido circondando l'area di ogni sezione tissutale. Assicurati che l'inchiostro non entri in contatto con la sezione stessa. Crea un cerchio il più vicino possibile a ogni sezione di tessuto senza entrare in contatto con il tessuto per minimizzare la superficie che deve essere coperta dalla soluzione di ibridazione.
   2. Preparare la soluzione di ibridazione: per ogni 50 μL di soluzione di ibridazione preriscaldata, aggiungere 0,5 μg di sonda (ad esempio, 0,5 μL di sonda da 1 μg/μL). Pipetta la soluzione di ibridazione sulle sezioni del veglione (~20 μL/sezione, a seconda della dimensione della sezione/cerchio). Proteggi la soluzione di ibridazione e le vetrine dalla luce da questo punto in poi durante le fasi di incubazione e lo stoccaggio.
   3. Assicurati che il volume di liquido utilizzato copra l'intera sezione dopo la sovrapposizione con un copertino flessibile in plastica. Incubare il vetrino in una camera umida per ridurre l'evaporazione. Crea una camera umida con una scatola a punta di pipetta con salviette o asciugamani di carta sul fondo imbevuti con una soluzione ibrida in eccesso o con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per fornire umidità. Incubare le sezioni a 45-50 °C, a seconda del set di sonde, per >3 ore.
   4. Riscaldare il tampone di lavaggio FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl a 50 °C durante il periodo di incubazione. Prepara abbastanza tampone per il lavaggio da coprire le vetrine nel barattolo di Coplin.
   5. Rimuovere i coperchi di plastica; incubare le vetrine in un tampone di lavaggio FISH in un barattolo Coplin, entrambe preriscaldate a 50°C. Rimetti il barattolo Coplin nel forno a 50°C per 10-20 minuti. Per campioni spessi, rimuovere le coperture nel barattolo Coplin aggiungendo il tampone e spostando delicatamente le coperture per evitare di spalmare la fetta.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Barattolo di coplin	Fisher	08-813E
Vetro di copertura, 22 × 22 mm, n. #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Risospeso a 5 mg/mL
Scatola vuota delle punte della pipetta			Per fondere la paraffina
Sonde FISH
Soluzione di ibridazione FISH	--	--	20 mM di pH Tris–HCl 7,4, 0,9 M di NaCl, 0,01% (w/v) SDS in acqua priva di nucleasi. Aggiunta opzionale di formamide dal 5 al 50% (v/v)
Buffer di lavaggio FISH	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl
Lectina Ulex Europaeus Agglutinina (UEA-1) marcata fluorescentmente	Laboratori Vector	FL-1061 (marcato con fluoresceina) o RL-1062-2 (marcato con rodamina)	UEA-1 marca glicani fucosilati, quindi non è appropriato per topi privi di germi o per campioni di ospiti carenti di fucosiltransferasi 2 (FUT2).
Pinza
Spallini flessibili in plastica HybriSlip, 22 x 22 mm × 0,25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	per le fasi di ibridazione FISH, si possono sostituire i vetrali in vetro
Penna Barriera Idrofobica ImmEdge	Laboratori Vector	H-4000
Kimwipes
Contenitori multiuso per la conservazione dei campioni, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Puoi sostituirlo con un contenitore di vetro o polietilene a tua scelta. Il metacarno non è compatibile con polistirene o metallo.
Smalto per unghie	Scienze della microscopia elettronica	72180	Qualsiasi smalto dovrebbe andare bene
Forno			Intervallo necessario: 45-60 °C
PBS, soluzione salina tamponata con fosfato (soluzione 10x)	Fisher	BP3991	Diluire a 1x per il protocollo
Cloruro di sodio	Fisher	S271
Soluzione di cloridrato di Trizma, 1M Tris-HCl, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Acqua, priva di nucleasi	Fisher	BP2484100