Isolamento basato su ultracentrifugazione delle vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila

Abstract

Fonte: Jung, A. L., et al. Vescicole della membrana esterna di Legionella pneumophila: isolamento e analisi del loro potenziale pro-infiammatorio sui macrofagi. J. Vis. Esp. (2017)

Questo video dimostra l'isolamento delle vescicole della membrana esterna (OMV) da Legionella pneumophila tramite centrifugazione sequenziale, filtrazione sterile e ultracentrifugazione. Gli OMV purificati, arricchiti con proteine di membrana e lipopolisaccaridi, sono adatti per studi di interazione ospite-patogeno.

Protocollo

1. Coltivare Legionella pneumophila

1. Diffondi il ceppo di L. pneumophila Corby (tipo selvatico, WT) su lastre agar con estratto di lievito di carbone (BCYE) tamponato e incubalo a 37 °C per 3 giorni. Inoculare 10 mL di brodo di estratto di lievito (YEB) a un OD₆₀₀ di 0,3 con L. pneumophila dalla piastra di precoltura; incubare i batteri a 37 °C su uno shaker rotante (150 rpm) per 6 ore.
2. Verifica la purezza della coltura liquida spargendo 100 μL della sospensione su una piastra di agar sanguigno. Incubare durante la notte a 37 °C.
3. Aggiungere la coltura liquida rimanente a 90 mL di mezzo YEB fresco e incubare su uno shaker rotante (37 °C e 150 rpm) per raggiungere un OD₆₀₀ di 3,0-3,5, che richiede circa 16-20 ore.

2. Preparare e quantificare le vescicole della membrana esterna (OMV) di L. pneumophila

NOTA: Eseguire tutti i seguenti passaggi di centrifugazione in condizioni sterili e a 4 °C.

1. Centrifuga la coltura liquida a 4.000 x g per 20 minuti per pelletare i batteri. Trasferire il soprandanante in tubi centrifughe freschi, eliminare il pellet batterico e ripetere la centrifugazione (4.000 x g per 20 minuti). Ripeti questo passaggio una volta.
2. Filtrare sterile il supernatant rimanente due volte (dimensione dei pori: 0,22 μm). Trasferire il surnatante senza batteri in tubi ultracentrifughe e ultracentrifugare a 100.000 x g per 3 ore.
3. Scartare il soprantantante e gettalo via. Risospendere il pellet OMV in soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) e in ultracentrifuga (100.000 x g per 3 ore) per rimuovere proteine contaminanti e LPS.
4. Scartare il soprandanante e risospendere il pellet OMV in 500 μL di PBS sterile. Strisciare 20 μL su una piastra di agar sanguigna e su una piastra agar BCYE per escludere la contaminazione batterica delle vescicole preparate. Incubare la piastra di agar nel sangue durante la notte e la piastra di agar BCYE per 3 giorni (entrambe a 37 °C).
   NOTA: La concentrazione di 100 mL di coltura di L. pneumophila è solitamente di 1 μg/μL. Conservare gli OMV preparati e quantificati a -20 °C.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra di Petri da 10 cm	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)	82.1473
Rotore da 70 Ti	Beckman Coulter Incorporation (California, USA)	337922
Cuvettes	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)	67.742
Incubatore CO₂ Heracell 240i	Thermo Fisher Scientific Germania BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Germania BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	75004515
Anello di inoculazione	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Germania)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---
PBS	Biochrom GmbH (Berlino, Germania)	L 1825
Shaker rotante (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Germania BV & Co KG (Braunschweig, Germania)	SHKE6000
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Inghilterra)	80-2116-30
Filtro sterile (dimensione dei pori: 0,22 μm)	Corning Incorporated (new York, USA)	431096
Carbone attivo	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	5210.2
Agar Columbia con 5% di sangue di pecora	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Germania)	254005
Estratto di lievito	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Germania)	2363.2