Isolamento e coltivazione di Caenorhabditis elegans-Batteri associati

Abstract

Fonte: Petersen, C. et al., Isolamento e caratterizzazione del microbiota naturale del nematode modello Caenorhabditis elegans. J. Vis. Esp. (2022)

Questo video dimostra l'isolamento e la coltivazione di specie batteriche associate a Caenorhabditis elegans. Una lisi a perla di C. elegans, seguita da una coltura selettiva, consente l'isolamento di diversi ceppi microbici per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Isolamento e coltivazione di batteri associati al nematode (Figura 1)

1. Per isolare i batteri, preparare una piastra da 96 pozzi con tre perle sterili da 1 mm, 20 μL di tampone M9 di sali medi minimi (M9) per pozzo, e pipetta un singolo nematode lavato in ciascun pozzo, trasferendo il minor liquido possibile.
   NOTA: In alternativa, le popolazioni di vermi possono essere lavate dalle piastre con il tampone M9, e ~300 μL di tampone M9 contenente vermi possono essere trasferiti in tubi da 2 mL con 10-15 sfere.
2. Scomponi i nematodi usando un omogeneizzatore delle perline (ad esempio, battere le perline per 3 minuti a 30 Hz). Centrifuga brevemente la piastra o i tubi per portare il liquido sul fondo (ad esempio, per 10 secondi a 8000 x g a temperatura ambiente, RT).
   NOTA: L'uso di questo metodo portò all'isolamento di taxa batterici simili a quelli rivelati dal sequenziamento degli ampliconi del DNA ribosomale 16S (rDNA), suggerendo che il battito delle perle descritto lasci intatte la maggior parte delle cellule batteriche.
3. Raccogli il soprandante, diluisci serialmente a 1:10 e impallisci fino a 100 μL su piastre agar da 9 cm.
   1. Per garantire che la maggior parte dei batteri possa essere coltivata, si utilizzano una varietà di mezzi alternativi con diverse composizioni nutrizionali, tra cui agar di soia tripticasa diluita (TSA, diluizione 1:10), agar MacConkey, agar glucosio Sabouraud, agar destrosio patata o agar destrosio peptonico al lievito.
4. Incubare le placche alle condizioni medie di temperatura del luogo di campionamento (ad esempio, temperature tra 15 e 20 °C per le zone temperate) per 24-48 ore.
5. Utilizzare la tecnica standard a tre striature e un anello sterile per ottenere colture batteriche pure (Figura 1).
   1. Prendi una singola colonia da una piastra usando un anello sterile o uno stuzzicadenti e strisciala su una nuova piastra di agar contenente lo stesso mezzo di agar usato per la purificazione. Assicurati di usare solo circa un terzo della placca.
   2. O usi un nuovo anello sterile oppure sterilizzi un anello riutilizzabile e trascinalo attraverso la prima striscia per creare una seconda striatura su un altro terzo della stessa placca.
   3. Ripeti questo passaggio trascinando un anello sterile attraverso la seconda stria.
   4. Incubare la piastra nelle stesse condizioni di crescita utilizzate per l'isolamento. Questa tecnica deve portare alla crescita di singole colonie nell'area della terza stria.
      NOTA: Potrebbe essere necessario ripetere la fase di purificazione più volte, poiché gli isolati naturali tendono a formare biofilm e/o aggregati.
6. Coltivare le colonie pure in un mezzo liquido (dello stesso tipo del mezzo per agar) utilizzando la stessa temperatura e tempi di crescita sopra (passo 1.4)

Risultati

Figura 1: Identificazione della specie e isolamento di singoli batteri. I singoli nematodi vengono scomposti utilizzando un omogeneizzatore a perle, e il DNA viene isolato per la determinazione della specie tramite PCR o sequenziamento. In altern...