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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
1. Isolamento della Comunità Batterica Intracellulare (IBC): Pipettazione Bucale degli IBC
NOTA: Tutti i metodi descritti in questa sezione sono stati sottoposti a una valutazione istituzionale del rischio. La pipetazione orale comporta il rischio intrinseco di ingestione della soluzione trasferita. Questo rischio è in gran parte mitigato dai volumi di nanolitri utilizzati da questo protocollo, e raccomandiamo a tutti gli utenti di prestare attenzione alle note precauzionali e di pratica elencate qui e nella discussione.
- Dopo che le cellule sono state raschiate nel PBS (soluzione salina tamponata con fosfato), installare l'apparato di micropipettura della bocca (Figura 1C).
- Inserisci l'estremità più spessa del capillare di vetro tirato (l'estremità non tirata) nel tappo di gomma (estremità bianca) del tubo aspiratore.
- Inserisci l'estremità stretta di una punta di pipetta da 1 mL nell'altra estremità aperta (rossa) del tubo aspiratore, assicurando un incastro stretto.
- Inserire l'estremità stretta di una pipetta aspirante da 2 mL nell'estremità aperta e più larga della punta da 1 mL, assicurando di nuovo un incastro stretto.
NOTA: Il risultato consente al ricercatore di fare la pipetta a bocca dall'estremità più larga e aperta della pipetta aspirante per creare una lieve forza di aspirazione dall'estremità stretta del tubo capillare all'estremità opposta dell'apparecchio. - Testare l'apparato finale di micropipetazione a bocca utilizzando una piastra di Petri da 100 mm contenente acqua deionizzata fresca. Una leggera azione di aspirazione all'estremità aperta della pipetta aspirante (simile a sorseggiare una bevanda con una cannuccia) dovrebbe aumentare il livello di liquido nel capillare, ma non far traboccare l'acqua deionizzata nel tubo aspiratore. Usa una mano per controllare il tubo capillare, mentre con l'altra per regolare la posizione della piastra di Petri.
NOTA: La forza di aspirazione richiesta per pipetare a bocca di un singolo IBC varia tra i ricercatori. Tuttavia, si raccomanda che ogni ricercatore che prova questa tecnica inizi con una debole aspirazione e la aumenti gradualmente se non scorre liquido lungo il capillare. Non c'è bisogno di una forza più grande del succhiare una cannuccia per bere. Se il capillare non sembra raccogliere liquido durante il test del passo 1.1.4, è possibile che sia il capillare che il tubo aspirante siano occlusi e debbano essere sostituiti. Si raccomanda inoltre che tutti i nuovi ricercatori si esercitino prima nel controllo della suzione nell'apparato di pipetazione orale, utilizzando acqua sterilizzata. Inoltre, si noti che il controllo del volume assunto dall'apparato di pipetazione della bocca avviene tramite l'uso della lingua del ricercatore. La lingua può regolare finemente la forza della suzione applicata, oltre a fungere da fermata d'emergenza. - Dopo aver ottenuto un assorbimento efficace del liquido, si prova la capacità di espellerlo dal capillare soffiando delicatamente all'estremità aperta della pipetta aspirante. Assicurarsi che non si formino bolle durante l'espulsione del liquido per prevenire la contaminazione degli IBC durante il passaggio 1.5.
NOTA: Come per la suzione, la forza della pressione positiva applicata dal ricercatore per espellere l'IBC nel tubo della centrifuga varierà tra i ricercatori. Si consiglia ai ricercatori alle prime armi di praticare il passo 1.1 pochi giorni prima dell'infezione vera e propria. Un suggerimento per praticare la micropipetazione orale è esercitarsi nel trasferire piccoli volumi di acqua sterilizzata mescolata con qualche goccia di colorante alimentare (per maggiore visibilità) utilizzando l'apparato della micropipetta orale.
- Posizionare la sospensione delle celle raschiate sotto il microscopio dissezionale e identificare gli IBC come grandi aggregati fluorescenti (Figura 1A, B). L'intervallo ideale di ingrandimento è 20-40x. Immergi l'estremità fine del capillare di vetro in un tubo fresco di PBS per 1 secondo, per ridurre l'assorbimento di volume indesiderato tramite l'azione capillare.
- Guardando al microscopio, identifica l'IBC di interesse e avvicina lentamente l'estremità aperta del tubo capillare verso l'IBC. Utilizzare l'estremità fine del capillare di vetro per spazzare via cellule extra vicino a ogni IBC, al fine di prevenire l'aspirazione di due o più cellule, o per rompere aggregati più grandi di cellule.
- Guardando al microscopio, applica una forza di aspirazione molto piccola all'estremità opposta (pipetta aspirante) dell'apparato di micropipetaggio a bocca per guidare l'IBC nel capillare di vetro.
- Dopo aver raccolto l'IBC, sposta il capillare su un tubo centrifuga vuoto da 1,5 mL e applica una leggera pressione positiva per espellere la goccia e l'IBC nel tubo della centrifuga (Figura 1D).
- Ripeti i passaggi 1.3-1.6 su quanti IBC più necessari sono necessari dalla vescica corrente, prima di procedere alla successiva. Cambia frequentemente le pipette aspiratrici e i capillari per prevenire l'accumulo di saliva.
ATTENZIONE: Quando si lavora con ceppi batterici infettivi (o clinici), monitora costantemente il livello di soluzione nel capillare. Non lasciare che il livello di liquido che viene pipettato trabocchi dal bordo del capillare nel tubo aspiratore. Se ciò accade, passa immediatamente a un tubo aspiratore diverso e scarta la configurazione precedente. - Ripetere i passaggi 1.2-1.6 su tutte le vesciche prelevate, oppure fino a quando non è stato raccolto un numero sufficiente di campioni biologici per il gruppo sperimentale.
- (Opzionale) Ripetere i passaggi 1.6 e 1.7 finché tutti i gruppi sperimentali (o topi) non saranno stati soppressi e sono stati prelevati campioni biologici sufficienti da ciascun gruppo.
