Rilevamento dell'espressione del genico bersaglio in un cervello di topo infettato da batteri

Abstract

Fonte: Zhang, S., et al. Via di infezione intracranica subaracnoide per l'indagine sui ruoli di Streptococcus suis Biofilms nella meningite in un modello di infezione murina. J. Vis. Esp. (2018).

Questo video dimostra la rilevazione dell'espressione genica bersaglio nel cervello di un topo infetto da batteri. L'RNA viene estratto, trattato con un enzima degradante del DNA e trascritto inversamente in cDNA. Il cDNA viene amplificato tramite ciclo termico con primer specifici per gene, mentre un colorante che lega il DNA si lega al DNA amplificato, emettendo fluorescenza. I segnali di fluorescenza vengono analizzati per confermare la presenza del gene bersaglio.

Protocollo

1. Preparazione dei batteri

Nota: il ceppo virulento di Streptococcus suis (S. suis) sierotipo 2 P1/7 è stato isolato da un maiale malato con meningite. Il ceppo P1/7 è stato coltivato nel brodo Todd-Hewitt (THB, formula per litro di THB: Infusione cardiaca, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; destrosio, 2,0 g; cloruro di sodio, 2,0 g; fosfato disodico, 0,4 g; carbonato di sodio, 2,5 g) e riportato su agar Todd-Hewitt (THA, formula per litro di THA: Infusione cardiaca, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; destrosio, 2,0 g; cloruro di sodio, 2,0 g; fosfato disodico, 0,4 g; carbonato di sodio, 2,5 g; agar, 15,0 g) a 37 °C e 5% di_CO2.

1. Raccolta delle cellule planctoniche del ceppo P1/7
   1. Raccogliere 5 mL di cellule planctoniche da colture a fase centrale (OD₆₀₀=0,6), centrifugare per 3 minuti a 8000 × g, e poi lavare 3 volte con soluzione salina tamponata fosfato (PBS).
   2. Risospendere le cellule con 5 mL di glicerolo al 25% in THB, aliquota in 5 tube, e poi conservare a -80 °C.
2. Raccolta delle cellule di stato del biofilm del ceppo P1/7
   1. Prendi 20 mL di una coltura notturna e aggiungi 180 mL di THB fresco; dividere la coltura diluita in modo equo in 10 piastre di coltura rotonde, poi mettere le piastre in un incubatore a 37 °C con il 5% di_CO2 per 24 ore.
   2. Dopo l'incubazione, scuotere delicatamente la piastra per risospendere i batteri che non si sono attaccati alla placca, poi elimina il soprantantante tramite aspirazione.
      NOTA: Scuotere delicatamente la piastra ed evitare di risospendere il sedimento.
   3. Aggiungere 5 mL di PBS per raccogliere le cellule dello stato del biofilm, risospendere completamente il sedimento e poi trasferire il campione in un nuovo tubo.
   4. Sonica le cellule dello stato del biofilm dall'ultimo passaggio con i seguenti parametri: 60 W, 4 cicli, 5 secondi accesi e 10 secondi spento.
   5. Centrifugare per 3 minuti a 8000 × g e conservare il soprantantante a -80 °C.
      NOTA: Il surnatante può contenere componenti di biofilm e può essere utilizzato per risospendere i batteri del biofilm prima dell'infezione come descritto negli esperimenti sugli animali (Passo 2).
   6. Risospendere il sedimento con 10 mL di glicerolo al 25% in THB e poi conservare le cellule dello stato del biofilm a -80 °C.

2. Esperimenti sugli animali

1. In questo studio utilizza topi femmine BALB/c di 6 settimane con SPF. Infettare tutti i topi attraverso la via intracranica subaracnoide dell'infezione, il cui sito di iniezione si trova a 3,5 mm rostrale dalla bregma.
   1. Per l'analisi istopatologica, infettare due gruppi di topi (5 topi per gruppo) utilizzando cellule plancttoniche o cellule dello stato biofilm a una dose di 3 × 10^{unità formanti di 7} colonie (CFU), e altri 5 topi sono stati iniettati con PBS come controllo.
   2. Per la rilevazione dell'espressione di mRNA di TLR2 e citochine nel cervello, infettare due gruppi aggiuntivi di topi (6 topi per gruppo) utilizzando cellule plancttoniche o cellule a stato biofilm a una dose di 3 × 10^{7 CFU} .
   3. Determina il numero di batteri vitali impiegando diluizioni seriali su THA.
   4. Eutanasia tutti i topi a 12 ore dall'infezione per ulteriori ricerche. ​
      NOTA: Il glicerolo nel mezzo di stocco deve essere rimosso prima dell'infezione. Sia le cellule planctonice che le cellule statali di biofilm recuperate da -80 °C vengono lavate 3 volte con PBS. Successivamente, le cellule planctoniche vengono risospese con PBS e diluite alla dose appropriata per l'infezione; Le cellule dello stato biofilm vengono risospese con il surnante immagazzinato (dal passaggio 1.2.5) e diluite alla dose appropriata per l'infezione. Il volume per l'infezione non deve superare i 50 μL.
2. Rilevamento dell'espressione di mRNA di TLR2 e citochine nel tessuto cerebrale
   1. Estrai l'RNA totale dal tessuto cerebrale utilizzando un kit di estrazione RNA.
      1. Per ogni topo, si utilizza l'intero tessuto cerebrale per estrarre l'RNA. Dividi tutto il tessuto cerebrale in 5 tubi. Prendi fino a 100 mg di tessuto cerebrale e aggiungi 1 mL di soluzione per la lisi a ogni tubo contenente la matrice di lisi fornita dal kit.
      2. Lavora il tubo in un omogeneizzatore per 40 secondi a una regolazione di 6,0, poi centrifuga il tubo a 12000 × g e 4 °C per 5 minuti.
      3. Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore in un nuovo tubo microcentrifuga.
      4. Incubare il campione trasferito per 5 minuti a temperatura ambiente; aggiungi 300 μL di cloroformio, vortice per 10 secondi, e poi incuba per 5 minuti a temperatura ambiente.
      5. Centrifuga il tubo a 12000 × g e 4 °C per 5 minuti. Trasferisci la fase superiore a un nuovo tubo.
      6. Aggiungi 500 μL di etanolo assoluto freddo al tubo prima di invertirlo 5 volte, e poi conserva il campione a -20 °C per almeno 1 ora.
      7. Centrifuga il tubo a 12000 × g e 4 °C per 15 minuti e rimuovi il surnatante. Lavare il pellet con 500 μL di etanolo freddo al 75% in acqua priva di RNasi (H₂O).
      8. Rimuovere l'etanolo, asciugare la pellet all'aria per 5 minuti a temperatura ambiente e risospendere l'RNA in 100 μL di H_2Oprivo di RNasi.
      9. Incubare l'RNA per 5 minuti a temperatura ambiente e determinare la concentrazione di RNA utilizzando un bioanalizzatore di RNA.
   2. Eseguire la sintesi del DNA complementare (cDNA), inclusa l'eliminazione del DNA genomico (gDNA), utilizzando un termociclatore con un kit di reagenti per trascrizione inversa (RT).
      1. Aggiungere 1 μg di RNA in un tubo contenente 2 μL di 5x tampone di eliminazione del gDNA, 1 μL di enzima di eliminazione del gDNA e H_2Osenza RNasi fino a raggiungere i 10 μL. Incubare per 2 minuti a 42 °C.
      2. Aggiungi 10 μL di master mix (1 μL di enzima RT Mix I, 1 μL di RT Primer Mix, 4 μL di 5x Buffer 2 e 4 μL di H₂senza RNasi) alla soluzione di reazione dell'ultimo passaggio e poi mescola delicatamente. Procedi immediatamente con la reazione RT: 37 °C per 15 minuti e poi 85 °C per 5 secondi.
      3. Eseguire l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi in tempo reale (RT-qPCR) utilizzando una macchina PCR in tempo reale con un kit SYBR RT-qPCR. Aggiungi 10 μL di 2x enzima, 0,8 μL di primer frontale, 0,8 μL di primer inverso, 0,4 μL di 50x ROX Reference Dye II, 2 μL di cDNA template e RNasi_{H 2}O fino a un volume totale di 20 μL.
      4. Eseguire ogni campione in triplicata utilizzando i seguenti parametri termici: 30 s a 94 °C, seguiti da 40 cicli da 5 s a 95 °C e 34 s a 60 °C, con una fase finale di 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C e 15 s a 95 °C. I primer per RT-qPCR sono elencati nella Tabella 1. I geni di mantenimento B2m e rRNA 18s venivano utilizzati come controlli interni.
   3. Calcola la variazione relativa della piega basandosi sul metodo ^2-ΔΔCt .

Tabella 1: Primer per RT-qPCR.

Nome Primer	Sequenza (5'-3')	Simbolo genico
IL-6 avanti	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	Il6
Retromarcia IL-6	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	Il6
TLR2 in avanti	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	Tlr2
Retromarcia TLR2	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC	Tlr2
Attaccante CCL2	CTCACCTGCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
CCL2 inversione	ACTACAGCTTTTTTGGGACAC	Ccl2
TNF-α avanti	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
TNF-α invertita	GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG	Tnf
β2m in avanti	GGTCTTTCTGTGTGCTTGTCT	B2M
β2m retromarcia	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2M
18 punti avanti	GTAACCCGTTGAACCCCATT	18s rRNA
18s rovescio	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18s rRNA

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Brodo di Todd Hewitt (THB)	Becton, Dickinson and Company	DF0492078	Sciogliere 30 g di polvere in 1 litro di acqua purificata. Autoclave a 121° per 15 minuti.
Agar	DSBIO	16C0050	Sciogliere 15 g della polvere in 1 L di THB. Autoclave a 121° per 15 minuti.
Sistema di Purificazione dell'Acqua di Riferimento Milli-Q	Merck KGaA	Z00QSVCUS	Senza Dnase/Rnase
NaCl	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd	10019318
Na₂HPO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009012-01-09
KCl	Xilong Scientific Co., Ltd	9009017-01-09
KH₂PO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009019-01-09
KOH	Xilong Scientific Co., Ltd	9009014-01-09
Glicerolo	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Diluito con lo stesso volume di acqua purificata, autoclave a 121° per 15 minuti
4% di paraformaldeide	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	80096675
25% glutaraldeide	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	30092436	Diluito 10 volte con acqua purificata per la fissazione.
Etanolo	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
Cloroformio	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10006818
Sclofotometro	DeNovix Inc.	DS-11+
Frantuitore di cellule a ultrasuoni	NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd	JY96-IIN
Centrifuga	Hitachi Koki Co., Ltd	CT15RE
Frigorifero	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
FastRNA Pro Green Kit	MP Biomedici	#6045-050
Strumento FastPrep-24	MP Biomedici	116005500
Strumento per PCR	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Biomedical Technology (Pechino) Co., Ltd	RR820A
Kit di reazione PrimeScript RT con gomma gDNA	Takara Biomedical Technology (Pechino) Co., Ltd	RR047A