Somministrazione in aerosol di Mycobacterium tuberculosis per infezione polmonare in un modello murino

Abstract

Fonte: Mueller, A., et al. Un modello sperimentale per studiare la coinfezione tubercolosi-malaria sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis e Plasmodium berghei. J. Vis. Esp. (2014)

Questo video dimostra la somministrazione in aerosol di Mycobacterium tuberculosis (Mtb) ai topi utilizzando un sistema a camera basato su nebulizzatore per indurre infezioni polmonari, fornendo un modello controllato e riproducibile per studiare la trasmissione aerea della tubercolosi e le interazioni ospite-patogeno in vivo.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Infezione da aerosol di topi con MTB utilizzando una camera aerosol Glas-Col

Il modo migliore per standardizzare l'infezione da aerosol negli animali sperimentali con Mtb (Mycobacterium tuberculosis) è utilizzare micobatteri provenienti da stock congelati con titoli noti per CFU (unità formanti di colonie). Per preparare le colture di stock, si coltura il Mtb nel brodo Middlebrook 7H9 integrato con un mezzo di arricchimento OADC (acido oleico, albumina, destrosio, Catalasi) e 0,05% Tween 80, fonte di carbonio per i micobatteri, e vengono adottate contemporaneamente misure per evitare l'aggregazione batterica. Le colture dovrebbero avere una OD (densità ottica) ≤ 1 al momento della raccolta. A un alto OD, aumenta l'aggregazione batterica e diminuisce la vitalità. Conservare 1 ml di aliquote a -80 °C. Determinare il numero di CFU vitali nelle scorte congelate impiattando una serie di diluizioni a 10 volte di tre fiale indipendenti su piastre di agar 7H11 integrate con glicerolo allo 0,5%, 1 g/L di asparagina e OADC e enumerando le colonie dopo 4 settimane di incubazione a 37 °C. Eseguire infezioni da aerosol come descritto di seguito.

1. Scongelare le scorte di titolo CFU noto e mescolare con cura la sospensione cinque volte per disperdere i grumi batterici usando una siringa da 1 ml dotata di un ago da 27 G. Evita la produzione di aerosol.
2. A seconda della dose di infezione desiderata, trasferire il volume richiesto del materiale micobatterico in un tubo da 50 ml contenente soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Il volume finale è di 6 ml.

NOTA: Variando il numero di microrganismi in questa sospensione, si varia la proporzione di batteri portanti gocce aerosol. Di solito puntiamo a un assorbimento di 100 bacilli vitali per polmone (infezione a basso dosaggio). Secondo la nostra esperienza, questo richiede circa 1-2 × 10⁶ Mtb/ml in un volume totale di 6 ml, di cui 5,5 ml sono nebulizzati. Si consiglia di effettuare una serie di prove sperimentali con aerosol con diverse concentrazioni di batteri per trovare le condizioni ideali per la tua infezione. Mentre infezioni ad alto dosaggio con fino a 5.000 micobatteri possono essere effettuate per accelerare il processo infettivo, anche solo 5 batteri possono essere utilizzati per infettare con successo i topi tramite aerosol. Il tasso di infezione è comunemente del 100%.

3. Rimuovere un volume sufficiente (preparato in eccesso del volume finale richiesto) per la placcatura e determinare il titolo dell'inoculo; Di solito rimuoviamo 500 μl per placcare triplicati tecnici.
4. Posizionare gli animali in un cesto a rete compartimentato (un topo per cestino) all'interno della camera circolare dell'aerosol e chiudere il coperchio della camera dell'aerosol.

NOTA: Altri modelli sono dotati di un cestino a forma di torta composto da cinque scomparti individuali, ciascuno dei quali può ospitare 20 topi.

5. Collega l'unità nebulizzatore Venturi ai tre giunti in acciaio inossidabile.
6. Rimuovere la sospensione micobatterica dal tubo da 50 ml con una siringa da 10 ml dotata di un ago smussato da 18 g e portare la siringa nella camera aerosol in una scatola di trasporto chiusa.
7. Rimuovi il tappo a vite dell'unità nebulizzatore e inietta con cura la sospensione di micobatteri nel nebulizzatore. Evita la generazione di aerosol. Getta la siringa in un contenitore per oggetti taglienti contenente il 2% di Buraton. Sigilla il nebulizzatore con il tappo a vite.
8. Accendi l'interruttore di alimentazione principale e la lampada UV. Il display sul tastierino di controllo mostra "Glas-Col Apparatus Co".
9. Accendi l'interruttore del programma. Il display mostrerà "Il nebulizzatore è pronto?" "Il cestello è caricato?" Premi invio quando sei pronto". Premi invio.
10. Il display mostra "Entra il tempo di preriscaldamento 900"; Questo significa che il tempo di preriscaldamento dell'inceneritore (che decontamina l'aria di scarico) è di 900 secondi. Premi Invio.
11. Il display mostrerà "Inserisci tempo di nebulizzazione 1.800"; Questo significa che il tempo di nebulizzazione è impostato di default a 1.800 secondi. Per estendere il tempo di nebulizzazione, inserisci "2.400" e premi invio.

NOTA: Durante il ciclo di nebulizzazione, l'aria sotto pressione atomizza la sospensione, generando così piccole gocce di aerosol contenenti micobatteri. Con il flusso d'aria principale, queste gocce (di circa 2-5 μm di dimensione) vengono trasportate nella camera aerosol.

 

12. Il display mostrerà "Entra in tempo di trasmissione 1.800"; Questo significa che il ciclo di decadimento dura 1.800 secondi. Imposta su "2.400" e premi Invio.

NOTA: Durante questo ciclo, la nube accumulata nella camera aerosol durante il ciclo di nebulizzazione può decaure. Le piccole gocce vengono inalate dagli animali sperimentali.

13. Il display mostrerà "Entra Dec Time 900"; questo significa che il ciclo di decontaminazione con luce UV richiederà 900 secondi. Premi invio. La macchina inizierà a passare attraverso preriscaldamento, nebulizzazione, decadimento delle nuvole e decontaminazione UV.
    ATTENZIONE: Il misuratore di flusso a vuoto dovrebbe indicare 60 piedi cubi/ora (controlla quando inizia il ciclo di preriscaldamento; regola la valvola di controllo del vuoto se necessario) e il misuratore di flusso dell'aria compressa 10 piedi cubi/ora (controlla quando inizia il ciclo di nebulizzazione; regola di conseguenza la valvola di controllo dell'aria).
14. Quando il ciclo è completato, la tastiera mostrerà "Processo completato – Rimuovi campione". Spegni il programma, le UV e l'interruttore di alimentazione principale.
15. Controlla se la sospensione micobatterica è stata completamente nebulizzata e, in caso contrario, registra il volume residuo rimuovendo con attenzione la sospensione con una siringa appropriata dotata di un ago smussato da 18 G. Il volume rimanente non dovrebbe superare 1 ml.
16. Rimuovi il nebulizzatore dalle giunture e mettilo in una teglia contenente Buraton al 2% per almeno 2 ore, di solito la disinfezione viene effettuata O/N. Successivamente, trasferisci il nebulizzatore in una padella nuova e risciacqua accuratamente con acqua. Lascia asciugare il nebulizzatore all'aria.
17. Apri la camera aerosol e rimetti gli animali nelle loro gabbie. Imballa i cestini in sacchi autoclave e autoclave. Pulisce le superfici interne della camera aerosol con Buraton al 2%.

NOTA: Per motivi di sicurezza, durante questa procedura si deve indossare un respiratore purificatore d'aria motorizzato.

18. Utilizzando i restanti 500 μl della sospensione micobatterica (vedi passo 1.3), si diluiscono 10 volte di un triplicatoare tecnico (3 x 100 μl) su piastre di agar 7H11.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buraton	Schülke		Ingredienti attivi: aldeidi (formaldeide, glutaraldeide, ossalaldeide, etil esanale)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	Per le colture di brodo MTB
Middlebrook 7H11	BD in Biologia	283810	Mezzo di agar per la coltura Mtb
Medio di arricchimento OADC Middlebrook	BD in Biologia	212240	Aggiungi a 7H9 e 7H11 per la cultura MTB
Sistema di esposizione all'inalazione	Glas-Col
Nebulizzatore-Venturi	Glas-Col