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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
1. Inoculazione con Pseudomonas aeruginosa
- Diluire durante la notte la coltura PAO1:lux a OD600 = 0,05 in 75 mL di mezzo per brodo di lisogena (LB) contenente 100 μg/mL di carbenicilina e far crescere i batteri fino a quando la coltura non raggiunge la fase esponenziale iniziale (OD600≈0,3). Questo dovrebbe richiedere circa 2–3 ore.
- Diluire PAO1:lux in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) a una concentrazione di (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/mL. Assicurati di preparare l'inoculo in eccesso per garantire un volume sufficiente e permettere la placcatura dopo l'esperimento. Se si trasporta tra le strutture, si utilizza un doppio contenimento in una scatola a prova di perdite chiaramente segnalata come Biohazard.
- Eseguire tutto il lavoro con P. aeruginosa e topi utilizzando dispositivi di protezione individuale approvati in un armadietto di sicurezza biologica (BSC) approvato per la biosicurezza animale di livello 2 (ABSL-2). Attrezzature riutilizzabili come la bilancia devono essere coperte con pellicola trasparente per prevenire l'incontaminazione.
- Anestetizzare il topo usando isoflurano al 3%. Pesa il mouse e registra il peso. Iniettare il topo sottocutaneamente con cloruro di sodio sterile preriscaldato, 250 μL su ciascun fianco, per un totale di 500 μL.
- Se la pellicola trasparente del topo si è staccata durante la notte, rimuovi con cura eventuali croste e applica una nuova medicazione.
- Utilizzare una siringa da 500 μL con tappo di sicurezza di tubercolina 27 G per iniettare 40 μL della sospensione PAO1:lux attraverso la medicazione trasparente in ciascuna ferita. Devono essere utilizzati topi diversi per i controlli della ferita non inoculata/PBS per prevenire la contaminazione incrociata dal lato controlaterale.
- Rimetti il topo nella gabbia su una borsa riscaldante e monitora finché non si sveglia. Tutti i topi dovrebbero essere ospitati singolarmente in gabbie separate per prevenire la contaminazione incrociata.
- Fornisci una pasta nutrizionale ad alto contenuto calorico inserita tra i pellet alimentari sul pavimento della gabbia.