Imaging bioluminescente delle infezioni batteriche nei topi

Abstract

Fonte: de Vries, C. R., et al., Un modello di inoculazione ritardata dell'infezione cronica da ferita da Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Esp. (2020).

Questo video mostra una tecnica di imaging bioluminescente per monitorare la progressione dell'infezione batterica in un modello murino vivo. I batteri patogeni ingegnerizzati con il sistema di segnalazione luxABCDE emettono luce nel sito di infezione, permettendo la visualizzazione dei batteri metabolicamente attivi. Attraverso l'imaging del topo nel tempo, i ricercatori possono monitorare in modo non invasivo la dinamica delle infezioni e quantificare l'intensità del segnale bioluminescente.

Protocollo

1. Preparazione e crescita dei batteri

1. Svolgere tutto il lavoro con P. aeruginosa e animali con precauzioni BSL-2 secondo le linee guida del comitato istituzionale di biosicurezza e del comitato per l'uso degli animali del ricercatore. Esegui tutti i passaggi qui descritti che coinvolgono P. aeruginosa, inclusa l'inoculazione dei topi, in un armadietto di biosicurezza.
2. La ceppa luminescente PAO1:lux di P. aeruginosa è disponibile dal nostro laboratorio su richiesta. Streak PAO1, conservato come stock di glicerolo congelato, su agar Lysogeny Broth (LB). Per il ceppo luminescente PAO1:lux, l'agar LB dovrebbe contenere antibiotici selettivi (100 μg/mL di carbenicillina e 12,5 μg/mL di kanamicina). Coltiva a 37 °C durante la notte in un incubatore batterico.
3. Scegli una colonia isolata e coltiva durante la notte a 37 °C in mezzo da 3 ml LB, pH 7,4. Per i ceppi luminescenti, il brodo dovrebbe contenere 100 μg/mL di carbenicilina. Cresci in condizioni di tremolio e aerobiche.

2. Preparazione della procedura

1. Fai indossare a tutto il personale che esegue l'intervento chirurgico con camice pulito/camice da laboratorio, mascherina, rete per capelli e guanti.
2. Autoclave di tutti gli strumenti chirurgici, inclusi forbici e pinze. Usa la tecnica asettica per sterilizzare gli attrezzi tra gli animali.
3. Pulisci il tavolo operatorio con etanolo e prepara un campo chirurgico pulito.

3. Depilazione

1. Anestesiare topi di 8–12 settimane di C57BL/6J usando isoflurano 1%–3%. Gli investigatori dovrebbero seguire le linee guida del personale veterinario dell'istituto per l'anestesia quando utilizzano l'isoflurano.
   1. Inizia l'anestesia somministrando isoflurano dall'1%–3% e regola la portata di ossigeno a 1,5 L/min. Metti il topo nella camera di induzione.
   2. Pizzica il dito del topolino per valutare la profondità dell'anestesia. Quando il topo non risponde più alla stimolazione, si rimuove dalla camera di induzione e si posiziona sul banco operatorio con il naso nel cono nasale di isoflurano.
   3. Applica lubrificante oculare su entrambi gli occhi.
2. Pesa il topo per ottenere un peso di base pre-procedura.
3. Metti il topo in posizione prona. Iniettare il topo sottocutaneamente con cloruro di sodio sterile preriscaldato, 250 μL su ciascun fianco, per un totale di 500 μL.
4. Rade la zona dorsale del topo usando un rasacapelli elettrico. La rasatura dovrebbe avvenire in un luogo diverso rispetto alla postazione chirurgica per prevenire la contaminazione dei capelli della ferita.
5. Applica uno strato sottile di lozione depilatoria. Lascia riposare la crema per 20–60 secondi. Rimuovere i capelli e l'eccesso di lozione con una garza inumidita in acqua tiepida. Dopo la depilazione, procedi con la procedura di lesione escisionale.

4. Chirurgia escisionale della ferita a spessore completo

1. Iniettare buprenorfina a rilascio prolungato 0,6–1 mg/kg sottocutaneamente utilizzando un ago da 25 G nella zona dorsale media del topo. La buprenorfina a rilascio lento offre sollievo dal dolore in 48–72 ore.
2. Disinfetta il sito chirurgico. Pulisce la superficie dorsale con un tampone sterile di betadina. Strofina l'eccesso di Betadine con un tampone alcolico sterile. Questo va eseguito 3 volte (alternando tra betadine e alcol), facendo il tampone spostandosi dal centro in modo circolare fino al bordo. Lascia asciugare l'area all'aria.
3. Crea un drappo intorno al sito chirurgico usando garze sterili o pellicola trasparente.
4. Allunga la pelle in modo caudale. Utilizzare un punzone sterile per biopsia cutanea di 6 mm di diametro per effettuare un'incisione iniziale attraverso l'epidermide dorsale sinistra. Ripeti sull'epidermide dorsale destra.
5. Usa le pinze per tendere la pelle dal centro dell'area della ferita contornata a sinistra. Elimina gli strati epidermico e dermico usando forbici. Ripeti sull'area della ferita delineata a destra per creare ferite essiccate simmetriche.
6. Lavare le ferite con 50 μL di soluzione salina sterile. Lascia asciugare all'aria il sito chirurgico e la pelle circostante. Poi, copri le ferite e il dorso con una medicazione trasparente.
7. Metti il topo in una gabbia pulita. Casa 1 animale per gabbia.
8. Metti la gabbia su un cuscinetto riscaldante e monitora finché il topo non si sveglia.
9. Quando si esegue l'intervento sopra descritto su più animali, si utilizza uno sterilizzatore a perle calde per pulire tutti gli strumenti chirurgici tra gli animali.
10. Prevedi 24 ore affinché i topi si riprendano dall'intervento chirurgico e per la formazione di una matrice provvisoria sulla ferita prima di procedere con l'inoculazione con i batteri.

5. Inoculazione con P. aeruginosa

1. Diluire la coltura PAO1:lux durante la notte a OD600 = 0,05 in 75 mL di mezzo contenente 100 μg/mL di carbenicillina e far crescere i batteri fino a quando la coltura non raggiunge la fase esponenziale iniziale (OD₆₀₀ ≈ 0,3). Questo dovrebbe richiedere circa 2–3 ore.
2. Diluire PAO1: lux in PBS a una concentrazione di (7,5 ± 2,5) x 10² CFU/mL. Assicurati di preparare l'inoculo in eccesso per garantire un volume sufficiente e permettere la placcatura dopo l'esperimento. Se si trasporta tra strutture (cioè dal laboratorio al vivario), si utilizza un doppio contenimento in una scatola a prova di perdite chiaramente segnalata come Biohazard.
3. Eseguire tutto il lavoro con P. aeruginosa e topi utilizzando dispositivi di protezione individuale approvati in un armadietto di sicurezza biologica (BSC) approvato per la biosicurezza animale di livello 2 (ABSL-2). Le attrezzature riutilizzabili, come la bilancia, devono essere coperte con pellicola trasparente per prevenire contaminazioni.
4. Anestesiare usando isoflurano al 3% come descritto sopra. Pesa il mouse e registra il peso. Iniettare il topo sottocutaneamente con cloruro di sodio sterile preriscaldato, 250 μL su ciascun fianco, per un totale di 500 μL.
5. Se la pellicola trasparente del topo si è staccata durante la notte, rimuovi con cura eventuali croste e applica una nuova medicazione.
6. Utilizzare una siringa da 500 μL con tappo di sicurezza di tubercolina 27 G per iniettare 40 μL della sospensione PAO1:lux attraverso la medicazione trasparente in ciascuna ferita. Devono essere utilizzati topi diversi per i controlli della ferita non inoculata/PBS per prevenire la contaminazione incrociata dal lato controlaterale.
7. Rimetti il topo nella gabbia su una borsa riscaldante e monitora finché non si sveglia. Tutti i topi dovrebbero essere ospitati singolarmente in gabbie separate per prevenire la contaminazione incrociata.
8. Fornisci una pasta nutrizionale ad alto contenuto calorico inserita tra i pellet alimentari sul pavimento della gabbia.
9. Usa l'inoculo rimanente per striare una piastra di agar LB. Contare le colonie per confermare il numero di batteri somministrati.

6. Imaging in vivo delle ferite infette

1. Segui i protocolli di contenimento BSL-2 per il trasporto dei topi da e verso lo strumento di imaging, incluso l'uso di un contenitore secondario. Fai attenzione a non trasferire o far cadere la lettiera dell'animale durante il passaggio del topo alla camera di induzione o allo strumento di immagini.
2. Indurre anestesia del topo con isoflurano inalato dall'1% – 3% in una camera di induzione.
3. Una volta anestetizzato, il topo viene posizionato in posizione prona nella camera di imaging di un sistema ottico con il naso nel cono nasale di isoflurano.
4. Apri il programma software.
5. I parametri di acquisizione varieranno in base al numero di animali fotografati simultaneamente e all'intensità della bioluminescenza. I parametri base da impostare includono il tempo di esposizione, il binning, il f/stop e il campo visivo (FOV). Le impostazioni di partenza predefinite sono: tempo di esposizione 30 secondi, binning basso (2), f/stop 1.2 e FOV 25. Regola queste impostazioni secondo necessità, a seconda delle esigenze del ricercatore.
6. Analizza i dati di luminescenza utilizzando un programma di imaging. La luminescenza sarà rappresentata come un'immagine pseudocolore sovrapposta a una fotografia a colori dei topi.
   1. Creare una regione di interesse (ROI) nel sito della ferita e misurare il flusso medio (fotoni/secondo) rilevato. Si noti che i dati possono anche essere riportati come radianza (fotoni/secondo/cm²/steradiano), ma finché la distanza della piattaforma di imaging dalla fotocamera rimane costante tra una visione e l'altra, il flusso è sufficiente.
   2. Misura il background creando un ROI in un'area casuale sulla piattaforma di imaging. Sottrai il numero di fotoni di fondo al secondo.
   3. Esporta i dati in un foglio di calcolo per un'analisi più approfondita.
7. Esegui immagini come descritto sopra ogni giorno per monitorare la progressione dell'infezione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Iniezione di cloruro di sodio allo 0,9%	Hospira	2484457
18 G x 1 ago sterile	BD	305195
25 G x 1 1/5 ago sterile	BD	305127
Tampone alcolico	BD	326895
Software per l'Aura Imaging	Imaging di Strumenti Spettrali	n/a
Betadine	Purdue Frederick Company	19-065534
Buprenorfina SR LAB	Zoopharm	n/a
Maschi C57BL/6J	Il Laboratorio Jackson	664
Perforatore per biopsia usa e getta, 6mm	Integra	33-36
Forbici fini - carburo di tungsteno	Strumenti scientifici di qualità	14568-09
Sterilizzatore a secco con perline di vetro	Apparato di Harvard	61-0183
Agar granulato	BioReagenti Fisher	BP9744
Cuscina Riscaldante	Milliard	804879481218
Siringa per insulina con ago da 28 G	BD	329461
Sistema di Imaging Lago X	Imaging di Strumenti Spettrali	n/a
Brodo LB	BioReagenti Fisher	BP1426
Siringa Leur-Lok 1 mL	BD	309628
Mini Arco Ceppo per Animali	Wahl Professional	919152
Lozione depilatoria Nair con olio per bambini	Church e Dwight	n/a	Disponibile in qualsiasi farmacia
Pinza Ottagono	Strumenti scientifici di qualità	11041-08
Piastra di Petri	Falcone	351029
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Pellicola trasparente e sigilla	Felice	n/a
Siringa di insulina SafetyGlide con ago da 30 G	BD	305934
Siringa di insulina Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Scala	Ohaus Scout Pro	SP202
Supplemento Nutrizionale Supplical	Henry Schein Salute Animale	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W