Test di coinfiltrazione per lo screening degli effettori patogeni che sopprimono il silenziamento dell'RNA vegetale

Abstract

Fonte: Shi, J., et al. Screening e identificazione dei soppressori silenzianti dell'RNA da effettori secreti di patogeni vegetali. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video mostra un saggio di coinfiltrazione per identificare proteine effettrici patogene che sopprimono il silenziamento dell'RNA in Nicotiana benthamiana 16c. Un reporter fluorescente e un gene candidato effettore vengono introdotti nelle foglie delle piante tramite Agrobacterium. Normalmente, il silenziamento dell'RNA degrada i trascrizioni dei reporter, riducendo la fluorescenza. Gli effettori soppressori bloccano questa risposta, preservando la fluorescenza. Questo saggio offre un metodo rapido e visivo per schermare gli effettori microbici che interferiscono con la difesa dell'ospite.

Protocollo

Coinfiltrazione Nicotianabenthamian a foglie

1. Mescolare volumi uguali di una coltura di Agrobacterium contenente 35S-GFP con una coltura di Agrobacterium contenente 35S-soppressore del virus mosaico del cetriolo 2b (CMV2b), un presuntivo effettore o un vettore vuoto (EV).
2. Infiltra con attenzione e lentamente le sospensioni miste di agrobatterium sui lati abassiali delle foglie di N. benthamiana 16c utilizzando una siringa senza ago da 1 mL.
3. Rimuovi la sospensione batterica residua dalle foglie con tergicristalli molli e circonda i margini delle chiazze infiltrate con un penna.
4. Lascia le piante infiltrate nella camera di crescita nelle stesse condizioni di crescita.
   
   NOTA: Per motivi di sicurezza e salute, durante l'infiltrazione devono essere indossati occhiali protettivi e mascherina. Per prevenire la contaminazione incrociata, i guanti devono essere cambiati o sterilizzati con etanolo tra le infiltrazioni. Normalmente sono necessari almeno 1 mL di sospensioni di agrobatterio per foglia per l'infiltrazione. Per il silenziamento sistemico, saranno necessarie almeno due foglie per l'infiltrazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Lampada UV	Analytik Jena	UVP B-100AP	Osservazione