Isolamento dei batteri dal centro intestinale della zanzara

Abstract

Fonte: Liu, X., et al. Un test orale batterico con zanzare trattate con antibiotici. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video mostra la dissezione dell'intestino centrale della zanzara per isolare i batteri intestinali. Il midintestin viene estratto dal tratto digerente, omogeneizzato per liberare i batteri e riposto su agar nutritivo per coltivare colonie batteriche.

Protocollo

1. Dissezionare il centro intestinale della zanzara
   1. Trasferire la zanzara sterilizzata in superficie sul vetrino di vetro con una goccia di 1x fosfato salino tamponato (PBS) sterile. Disseziona sotto il microscopio dissezionale.
   2. Sotto l'ingrandimento inferiore del microscopio dissezionale, rimuovere con attenzione zampe, ali e testa della zanzara per evitare la fuga. Rimuovi l'ultimo somite della zanzara tagliando direttamente, invece di tirarlo, per evitare che il tratto digestivo si rompa.
   3. Pinza il torace della zanzara e l'estremità dell'addome con una pinza. Estrai delicatamente il tratto digestivo della zanzara. Il tratto digestivo acquisito di solito contiene il raccolto, il prosintestino, l'intestino medio, l'intestino posteriore e i tubi di Malpighia.
   4. Regola il microscopio dissezionante a un ingrandimento più alto. Rimuovere il raccolto, il prosintestino, l'intestino posteriore e i tubi di Malpighi dal tratto digestivo dissezionato per ottenere il centro intestinale della zanzara.
   5. Fai attenzione durante la rimozione della coltura, perché la coltura si gonfia e assomiglia all'intestino centrale dopo che la zanzara ha preso una farina di zucchero. I tubi di Malpighi, un gruppo di tubi escretori lunghi e sottili, si trovano al confine tra l'intestino medio e quello posteriore.
2. Isolare i batteri intestinali
   1. Trasferire il intestino medio dissezionato in un tubo sterile da 1,5 mL con 200 μL di buffer sterile 1x PBS.
   2. Macina accuratamente il mezzointestino su una panca sterile con un pestello sterile per permettere il rilascio completo dei batteri intestinali al tampon.
   3. Diluire serialmente l'omogeneato in tre diluizioni di 10 volte. Aggiungi 50 μL di ogni diluizione alla piastra di agar LB (brodo Luria) e spargili sulla placca. Se il mediointestino contiene un'alta concentrazione di flora intestinale, è essenziale effettuare più diluizioni seriali per individuare singole colonie.
   4. Incubare la piastra a 37 °C per 1–2 giorni finché non si vedono colonie singole.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Aedes aegypti			Zanzare femmine
Tubo centrifuga	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 mL, naturale, graduato, sterile
Pestell usa e getta per macinare il tessuto	Sangon Biotech	F619072-0001	Lunga 70 mm, conica, blu, sterile
Pinza	RWD	F11029	Dissezione
Polvere di agar LB	Sangon Biotech	A507003	Triptone 10,0 g, Estratto di lievito 5,0 g, NaCl 10,0 g, Agar 15,0 g.
Microscopio	Zeiss	Stemi508
Buffer PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Questo prodotto è una soluzione 10X. Per favore, diluisci 10 volte prima dell'uso. Il valore del pH è 7,4.