Stabilire una popolazione batterica intestinale definita nelle zanzare adulte

Abstract

Fonte: Liu, X., et al. Un test orale batterico con zanzare trattate con antibiotici. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video dimostra la diminuzione del microbiota intestinale nativo nelle zanzare utilizzando una soluzione contenente saccarosio contenente antibiotici. Segue una ricolonizzazione controllata con una sospensione batterica somministrata tramite un sistema di alimentazione a membrana per stabilire una popolazione batterica definita nell'intestino della zanzara.

Protocollo

1. Trattamento antibiotico e reintroduzione dei batteri

1. Prepara la soluzione antibiotica.
   1. Pesa la quantità richiesta di saccarosio, penicillina e streptomicina per preparare una soluzione al 10% di saccarosio che include 20 unità di penicillina e 20 μg di streptomicina per mL.
2. Nutri le zanzare con la soluzione antibiotica.
   1. Anestetizzare le zanzare a 4 °C per 3–5 minuti. Trasferisci le zanzare in un bicchiere di carta. Copri la parte superiore con garze e chiudi la garza con del nastro adesivo per evitare che le zanzare scappino.
   2. Immergi dei batuffoli di cotone sterili nella soluzione antibiotica e posizionali con cura sulla coppa antizanzara. Stringi i batuffoli di cotone prima dell'uso per evitare che le zanzare annegino nei batuffoli gocciolanti.
   3. Copri i batuffoli di cotone con una piastra di Petri da 10 cm per evitare l'evaporazione dell'umidità. Sostituisci i batuffoli di cotone due volte al giorno per tre giorni consecutivi.
3. Preparazione della sospensione batterica
4. Misura la soluzione batterica con uno spettrofotometro. Aggiungi 1 sospensione batterica OD (OD₆₀₀) in un tubo da 1 mL. Centrifuga la sospensione a 5.000 x g per 5 minuti a 4 °C.
5. Scartare il soprandanante e aggiungere 1 mL di buffer sterile 1x PBS a un tubo da 1,5 mL per la precipitazione in sospensione.
6. Centrifugare a 5.000 x g per 5 minuti a 4 °C; Scartate il soprandatante.
7. Ripeti i passaggi 2.4.2 e 2.4.3.
8. Aggiungi 200 μL di soluzione salina 1x tamponata con fosfato (PBS) sterile alla precipitazione batterica.
9. Aggiungere 600 μL di soluzione al 10% di saccarosio, 200 μL di 10 mm di adenosina 5′-trifosfato (ATP), che agisce come fagostimolante, e 200 μL di sospensione batterica in un tubo sterile da 1,5 mL. Mescola tramite vortice.
10. Nutri la zanzara con la sospensione batterica.
    1. Affamare le zanzare per 24 ore, permettendo agli antibiotici di metabolizzarsi prima di nutrire i batteri.
    2. Assemblare il sistema di alimentazione a membrana.
    3. Sigilla l'unità di alimentazione sterilizzata con parafilm o, in alternativa, con una membrana di collagene.
    4. Metti un anello di plastica e fissalo con parafilm per evitare che si rompa a causa dell'attrito durante l'alimentazione.
    5. Aggiungi lentamente la soluzione batterica preparata all'unità alimentare.
       Nota: Solo un pozzo dell'unità di alimentazione a due pozzi può essere riempito con la soluzione, e coprire l'unità di alimentazione solo dal lato di gocce di reagenti.
    6. Collega l'unità alimentatrice a un sistema di alimentazione preriscaldato a 37 °C, che simula la temperatura umana per attirare le zanzare. Metti il dispositivo per l'alimentazione su un bicchiere di carta pieno di zanzare e dai da mangiare per 90 minuti.
    7. Dopo l'alimentazione, anestetizzare le zanzare sottoponendole a una temperatura di 4 °C per 3–5 minuti e mantenerle anestetizzate in una piastra di Petri gelata.
    8. Scegli le zanzare completamente gonfie per ulteriori studi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Adenosina 5′-trifosfato sale disodio idrato	Sigma	A2383	L'adenosina 5′-trifosfato salare disodico idrato è stata utilizzata per preparare soluzioni standard di adenosina trifosfato (ATP)
Sistema di alimentazione a membrana Hemotek	Hemotek		Componenti del sistema di alimentazione, tra cui il regolatore di temperatura Hemotek, l'assemblaggio alloggiamento del mangiatore, il sistema metallico di alimentazione.
Parafilm	Sangon Biotech	F104002	4 in x 125 ft
Piastra di Petri	Sangon Biotech	F611203
Idratazione del sale di procaina di penicillina G	Sangon Biotech	A606248	Polvere bianca. Solubile in acqua, solubile in metanolo, leggermente solubile in acqua, etanolo
Solfato di streptomicina	Sangon Biotech	A610494	Lo streptomicino solfato è un antibiotico glucosaminanico che interferisce con la sintesi delle proteine procariotiche.
Sucrosio	Sangon Biotech	A502792	Solubile in acqua, etanolo e metanolo, leggermente solubile in glicerolo e piridina.
Buffer PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Questo prodotto è una soluzione 10X. Per favore, diluisci 10 volte prima dell'uso. Il valore del pH è 7,4.