Imaging dal vivo della morte cellulare dei macrofagi durante un'infezione micobatterica negli embrioni di pesce zebra

Abstract

Fonte: Niu, L., et al. Visualizzazione della morte cellulare litica dei macrofagi durante un'infezione micobatterica negli embrioni di pesce zebra tramite microscopia intravitale. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video dimostra l'uso della microscopia confocale intravitale per visualizzare la morte delle cellule litiche dei macrofagi negli embrioni di pesce zebra dopo un'infezione da Mycobacterium marinum .

Protocollo

1. Imaging dal vivo dell'infezione

1. 1. Montaggio per pesci per immagini live
   1. Trasferire fino a 10 embrioni anestesiati con tricaina al centro di una ciotola di vetro da 35 mm. Scarta il medium extra E3.
   2. Copri il piatto con un 1% di agarosio a basso punto di fusione e orienta con attenzione gli embrioni di pesce zebra usando un ago da 10 G. Incuba la teglia di vetro sul fondo del ghiaccio per 10 secondi per solidificare l'agarosio.
      NOTA: Per l'iniezione del mesencefalo, gli embrioni devono essere montati nell'agarosio con la testa rivolta verso l'alto (Figura 1A).
   3. Una volta completamente solidificata, copri l'agarosio con uno strato di acqua di uovo (più 1 x tricaine e PTU (N-feniltiourea)).
2. Microscopia confocale a tempo a tre colori ad alta risoluzione
   NOTA: I passaggi seguenti sono eseguiti su una microscopia confocale equipaggiata con una lente obiettivo UV a olio 63,0x 1,40.
   1. Imposta la temperatura della camera ambientale a 28,5 °C. Inserisci un po' di carta velina bagnata all'interno della camera per fornire umidità e prevenire l'evaporazione dell'acqua dell'uovo.
   2. Metti la ciotola di vetro da 35 mm con il pesce zebra nella camera ambientale.
   3. Apri il software confocale e inizia lo stadio. Passa all'obiettivo UV a olio 63.0 x 1.40 e localizza il pesce zebra usando il canale del campo chiaro con un filtro a contrasto di interferenza differenziale (DIC).
   4. Apri il diodo da 405, l'argon (20% di potenza) e il laser DPSS da 561 nm. Imposta le impostazioni di potenza e spettro del laser appropriate.
      NOTA: Di seguito sono riportate le impostazioni di spettro per Cerulean (eccitazione = 405 nm; emissione = ~456–499 nm), eGFP (eccitazione = 488 nm; emissione = ~500–550 nm), DsRed2 (eccitazione = 561 nm; emissione = ~575–645 nm)
   5. Scegli la modalità di acquisizione "XYZ" "Scansione Sequenziale" e imposta il formato immagine su "512 x 512 pixel".
   6. Passa alla "modalità Live Data". Mira alla posizione del primo pesce zebra e segna la posizione "Inizio" e "Fine" Z. Ripeti questo processo per ciascuno degli embrioni rimasti. Alla fine del programma si può aggiungere una "Pausa".
   7. Definisci il ciclo e il ciclo del programma.
   8. Salva il file.

Risultati

Figura 1: Montaggio degli embrioni di pesci zebra per immagini dal vivo. (A) Per l'infezione del mesencefalo, gli embrioni dei pesci zebra venivano montati con la testa rivolta verso il basso. (B) Per...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Un palco con fondo di vetro da 35 mm	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Microscopio confocale	Leica	TCS SP5 II
Camera Ambientale	Pecon	Controllo temperatura 37-2 digitale
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
N-feniltiourea (PTU)	Sigma	P7629