Valutazione in vitro della uccisione batterica da parte dei fagociti splenici neonatali del topo

Abstract

Fonte: Seman, B. G., et.al. Modello di imaging neonatale della sepsi batterica Gram-negativa. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video dimostra l'isolamento di neutrofili e monociti infiammatori dalle milze neonatali di topo e la loro applicazione in un saggio batterico luminescente che uccide. Copre la dissociazione meccanica, la lisi dei globuli rossi, l'arricchimento cellulare a base di perle magnetiche, l'incubazione batterica e la protezione antibiotica. Le letture di luminescenza a tempo indicano l'internizzazione batterica iniziale seguita da una liberazione mediata dal sistema immunitario.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali competente.

1. Saggio batterico in vitro per uccidere i batteri

1. Rimuovi la milza da un cucciolo neonatale non infetto e mettila in un cesto di nylon da 40 μm all'interno di una piastra di Petri sterile da 60 mm. Ripeti questo e si raccoglie le milze in un unico tubo da prelevare e omogeneizzare insieme.
2. Aggiungere 5 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) integrata con siero bovino fetale al 10% (FBS).
3. Smembrare il tessuto con uno sturalavandini sterile da 3 mL fino a creare una sospensione a singola cellula.
4. Raccogli la sospensione a singola dall'esterno del cestello di nylon, trasferisci in un tubo centrifugo da 15 mL e inserisci le celle a 350 x g per 5 minuti.
5. Sospendere le cellule in un tampone di lisi dei globuli rossi (2 mL per un massimo di 7-8 milza) e lasciarle riposare per 5 minuti a temperatura ambiente per eliminare gli eritrociti.
6. Lava gli splenociti con PBS e pellet come sopra.
7. Sospendere gli splenociti in 0,25 mL di PBS integrato con 0,5% di BSA e 2 mM di EDTA secondo la resa cellulare attesa.
8. Contare gli splenociti utilizzando un emocitometro o un'altra applicazione appropriata.
9. Isolare le cellule Ly6B.2⁺ (popolazione mieloide di granulociti/monociti infiammatori) con sfere immunomagnetiche.
10. Seme le cellule Ly6B.2⁺ a una densità di 1 x 10⁵ celle per pozzo in una piastra nera o bianca a 96 pozzi in un volume di 0,1 mL di DMEM che contiene il 10% di FBS, 2 mM di glutamine e 25 mM di HEPES (mezzo completo).
11. Enumerare E. coli bioluminescente e preparare l'inoculo batterico alla molteplicità di infezione desiderata (MOI) in un volume finale di 0,1 mL. Questo si fa meglio realizzando ciò che è necessario per tutti i pozzi in un comune MOI in lotti.
12. Aggiungi 0,1 mL di inoculo batterico o un mezzo intero da solo come controllo. Incubare la piastra multi-pozzo a 37 °C e 5% di_CO2 per 1 ora.
13. Sostituisci il substrato con 0,2 mL di substrato fresco completo che contiene gentamicina (100 μg/mL) rimuovendo delicatamente il substrato con una pipetta e aggiungendo materiale fresco con una punta nuova per pipetta. Riporta la coltura in incubazione per altre 2 ore.
14. Dopo 3 ore dall'infezione, misurare la luminescenza in ciascun pozzo della piastra di coltura con coperchio dal fondo utilizzando un lettore di placche e poi riportare la coltura all'incubazione.
15. Ripetere le misurazioni della luminescenza in altri momenti temporali desiderati.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Buffer di lisi ACK	Gibco	LSA1049201	Analisi di eliminazione batterica
Microperle Anti-Ly-6B.2	Miltenyi Biotec	130-100-781	Isolamento cellulare
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (esprime luciferasi)	N/A	N/A	Costruita internamente presso la WVU
Buffer di isolamento	Miltenyi Biotec	N/A	Analisi di eliminazione batterica
LB Broth, Lennox	BioReagenti Fisher	BP1427-500	Crescita batterica
Colino EASYstrainer (Cestello in nylon)	Greiner Bio-one	542 040	Filtro cellulare
SpectraMax iD3	Dispositivi molecolari	N/A	Lettore di targhe