Modellazione dell'infezione nei topi neonatali utilizzando batteri bioluminescenti incapsulati

Abstract

Fonte: Seman, B. G., et al. Un modello di imaging neonatale della sepsi batterica Gram-negativa. J. Vis. Esp. (2020)

Il video mostra un modello neonatale di topo per studiare l'infezione sistemica utilizzando batteri bioluminescenti incapsulati. I cuccioli neonatali vengono iniettati con sospensioni batteriche ad alto o basso dosaggio e restituiti alla madre per le cure postnatali. I batteri incapsulati sfuggono alla rilevazione immunitaria precoce, si diffondono sistemicamente e vengono visualizzati nel tempo tramite immagini di luminescenza. Questo modello consente il monitoraggio non invasivo della progressione dell'infezione nei topi neonatali.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Preparazione dell'inoculo batterico

1. Strisciare una piastra triptica di agar di soia (TSA) con un anello inoculante per l'isolamento di una singola colonia da una scorta congelata di Escherichia coli O1:K1:H7-lux che esprime stabilmente la luciferasi e porta resistenza alla kanamicina. Incubare durante la notte a 37 °C.
2. Il giorno seguente, lascia che il brodo Luria (LB) raggiunga la temperatura ambiente (25 °C) in un armadietto di biosicurezza.
3. Sotto un cappuccio di biosicurezza, identificare una singola colonia dalla piastra striata e inocularla in 3 mL di LB integrati con kanamicina (30 μg/mL). Incubare durante la notte a 37 °C con scuotimento a 220 giri al minuto (rpm). Questa è la cultura degli starter.
4. Diluire la coltura iniziale 1:100 in un fresco 3 mL di LB sotto un cappuccio di biosicurezza e riportarla nell'incubatrice per 2-3 ore a 37 °C con agitazione (220 rpm). Questa è la cultura della borsa.
5. Leggere la densità ottica (OD) sia della cultura a vuoto che di quella di stocco a 600 nm utilizzando uno spettrofotometro. Aggiungere 100 μL di LB (senza batteri) in un pozzo di una piastra di analisi a fondo piatto da 96 pozzi; Questo è il vuoto. Poi aggiungi 100 μL dalla cultura di stocco in un pozzo separato. Ripeti per due repliche aggiuntive. L'assorbanza viene rilevata tramite un lettore di lastre.
6. Sottrai l'assorbanza a vuoto dal valore di assorbenza della coltura stock (il valore OD) e confronta con una curva di crescita precedentemente generata e validata per determinare un'approssimazione della densità batterica nella coltura stock per la preparazione della dose infettiva.
7. Genera inocula target in base alla domanda di ricerca. Per questo studio sono stati utilizzati inoculari bersaglio di 2 unità di formazione di colonie (CFU) (10⁶) (basse) e 7 x 10⁶ (alta) per topo (/mouse).
   1. Dividere la dose target per topo (DoseT) per la concentrazione stimata di batteri nella coltura stock (stock) per ottenere il volume di batteri necessario dal tubo stock (VS).
   2. Moltiplica il VS per il numero di topi (NM) che devono essere infettati, insieme a abbastanza per 5-10 extra, per il totale di batteri necessari per l'infezione, più 5-10 dosi aggiuntive. Rimuovi questo volume dal tubo originale e aggiungilo a un nuovo tubo centrifuga.
   3. Usa l'equazione qui sotto: DoseT/Stock = VS x NM = volume totale (VT) dei batteri da rimuovere dal tubo stock.
8. Centrifugare i batteri a 2.000 x g per 5 minuti a 4 °C e risospendere il pellet batterico in 50 μL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,2-7,6) per ogni topo da infettare (ad esempio, per 10 dosi di 2 batteri 10⁶ per dose, il pellet di 2 batteri 10⁷ verrà risospeso in 500 μL PBS). Ancora una volta, si raccomanda di preparare più inoculo del necessario. Prepara un volume uguale di PBS solo per le inoculazioni di controllo. Mantieni il controllo dell'inoculo infettivo e del PBS sul ghiaccio fino all'infezione.
9. Eseguire sette diluizioni seriali dieci volte in PBS in una piastra di diluizione plastica a 96 pozzi, e la lastra 25 μL delle diluizioni in duplicato su piastre TSA a quadrante integrate con kanamicina (30 μg/mL) per enumerare la quantità effettiva di batteri somministrati. Incubare a 37 °C durante la notte per la formazione della colonia prima dell'enumerazione.

2. Identificazione degli animali

1. Organizza un numero sufficiente di coppie riproduttive in modo che le cucciolate possano essere sincronizzate per i cuccioli con un'età corrispondente. Una variabilità dell'età di ± 1 giorno è accettabile.
2. Identificare una femmina di topo C57BL/6 in gravidanza e monitorare la nascita della cucciolata prima dell'esperimento previsto per determinare con precisione l'età.
3. Per distinguere tra cuccioli di controllo e infestati di 3 o 4 giorni, usa una coppia di piccole forbici a punta fine per l'iride per tagliare solo le estremità della coda dei cuccioli di controllo. I cuccioli infetti non ricevono le taglie della coda. Prima di tagliare la coda, disinfetta la pelle con un batuffolo di cotone ricoperto al 70% di etanolo. Applica pressione all'estremità della coda con un batuffolo di cotone o garza, se necessario.
   NOTA: Questa procedura viene eseguita sotto un cappuccio di armadietto di biosicurezza. Un taglio della coda di circa 1/8 di pollice è sufficiente.
4. Per identificare i cuccioli all'interno dei gruppi di controllo e infetti, si utilizza una siringa di insulina da 1 mL con un ago permanente da 28 G x 1/2'' per tatuare le code dei cuccioli. Prima di tatuare, disinfetta la pelle con un batuffolo di cotone ricoperto al 70% di etanolo. Questa procedura viene eseguita sotto un cappuccio di armadietto di biosicurezza.
5. Per tatuare la coda, applica l'inchiostro per tatuaggi animali sulla punta dell'ago. Poi, trattieni con cura il cucciolo con una mano, con la coda completamente scoperta. Inserisci delicatamente l'ago sotto la pelle, mantenendo un livello superficiale di profondità, e sposta l'ago parallelo alla pelle di qualche millimetro finché non si crea un piccolo segno, o puntino. Aspetta qualche secondo prima di rimuovere lentamente l'ago da sotto la pelle, per evitare che si rilasci un eccesso di inchiostro da sotto la pelle.
6. Applica pressione sulla ferita con un batuffolo di cotone o una garza se necessario. Rimuovere l'inchiostro in eccesso sulla superficie della pelle con etanolo al 70%.
7. Ripeti questo processo con i topi successivi nei gruppi infetti e di controllo, aggiungendo un punto aggiuntivo con ogni cucciolo tatuato (ad esempio, il cucciolo 1 avrà un puntino sulla coda, il cucciolo 2 due puntini sulla coda, ecc.).
   NOTA: Per un ulteriore livello di identificazione, si raccomanda di utilizzare colori separati di inchiostro per tatuaggi animali per i gruppi di controllo e infetti.

3. Inoculazione subscapolare

NOTA: Per questo studio, sono stati condotti 2 esperimenti con un gruppo a bassa dose e uno ad alta dose designato per ciascun esperimento. Nel primo esperimento, 7 cuccioli hanno ricevuto l'inoculo a basso dosaggio (4 cuccioli sono stati usati come controlli), e 5 cuccioli di una cucciolata separata hanno ricevuto la dose alta (3 cuccioli sono stati usati come controlli). I cuccioli dell'esperimento 1 fornivano dati solo per il periodo di 24 ore. Nel secondo esperimento, 8 cuccioli sono stati somministrati l'inoculo a bassa dose (2 cuccioli sono stati usati come controlli) e 6 cuccioli hanno ricevuto l'inoculo ad alta dose (2 cuccioli sono stati usati come controlli). I cuccioli dell'esperimento 2 fornivano dati per i punti temporali 0, 10 e 24 ore.

1. Cuccioli di età corrispondente ≤ 1 giorno. Assegna ogni cucciolata come a basso o ad alta dose. All'interno di una cucciolata, assegna casualmente i cuccioli come controllo o come cuccioli di controllo infetti.
2. Al terzo o quarto giorno postnatale, registra i pesi di tutti i cuccioli prima dell'inoculazione con E. coli-lux o il controllo PBS. Separare la madre dai cuccioli durante questo periodo per assicurarsi che non vengano spostati durante l'infezione.
3. All'interno di un armadietto di biosicurezza utilizzando un ago per insulina, aspirare PBS o l'inoculo di E. coli-lux . Per questo lavoro sono stati utilizzati inoculi di 2 x 10⁶ e 7 x 10⁶ CFU per topo. Tieni sia l'inoculo infettivo che il PBS in ghiaccio fino alla somministrazione tramite iniezione subscapolare.
4. Posiziona il neonato su una superficie pulita nel cappuccio dell'armadietto di biosicurezza e solleva la pelle sulla nuca come per stringere il cucciolo.
5. Nello spazio ora creato tra la pelle e il muscolo dell'animale, inserire l'ago, smussare verso l'alto, appena sotto la pelle, e iniettare 50 μL di PBS o E. coli-lux. Rilascia contemporaneamente la parte di pelle pizzica per prevenire il reflusso di iniezione.
6. Rimuovi l'ago lentamente e con attenzione. Rimetti i cuccioli alle madri dopo le iniezioni. NOTA: A causa della loro fase anatomica dello sviluppo, è tecnicamente difficile somministrare una vena caudale o un'iniezione intraperitoneale ai cuccioli neonatali al terzo e quarto giorno. Pertanto, per questo studio è stata scelta la via dell'infezione subscapolare per la facilità di esecuzione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 mL di siringa per insulina	Coviden	1188128012	Iniezione di inoculo o PBS
Pasta per inchiostro per tatuaggi animali	Ketchum	KI1482039	Identificazione animale
Inchiostro per tatuaggi animali Pasta verde	Ketchum	KI1471039	Identificazione animale
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (esprime luciferasi)	N/A	N/A	Costruita internamente presso la WVU
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Agar di soia triptico Difco	Becton, Dickinson and Company	236950	Crescita batterica
Software per CT e Immagini Viventi IVIS Spectrum 4.5	Perkin Elmer	N/A	Imaging intravitale
LB Broth, Lennox	BioReagenti Fisher	BP1427-500	Crescita batterica