Rilevamento in situ di batteri nelle sezioni di tessuto gingivole del topo

Abstract

Fonte: Choi, Y. S., et al. Rilevamento in situ di batteri all'interno di tessuti incorporati in paraffina utilizzando una sonda di DNA marcato con digossina che prende di mira il rRNA 16S. J. Vis. Esp. (2015).

Questo video dimostra la rilevazione in situ di batteri in sezioni di tessuto gengivale del topo utilizzando sonde di DNA marcate con digossina che mirano al DNA batterico. La sezione viene incubata con la sonda. Vengono aggiunti anticorpi coniugati con fosfatasi alcaline specifici per la digossina. Le fosfatasi endogene vengono inattivate e un precipitato colorato viene ottenuto tramite aggiunta di substrato. La sezione viene contro-colorata, disidratata, rimossa nello xilene e montata prima della visualizzazione microscopica dei batteri.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono campioni animali sono state esaminate e approvate dal comitato di revisione etica degli animali competente.

1. Preparazione della sonda

1. Amplificazione PCR della sonda
   1. Per la sonda specifica di Porphyromonas gingivalis, amplificare un frammento di DNA a 343 bp del rRNA 16S di P. gingivalis tramite PCR utilizzando il DNA genomico di P. gingivalis e i seguenti primer: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' e 5'- ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. Eseguire amplificazioni con le seguenti condizioni di ciclo: 35 cicli a 95 °C per 30 secondi, 60 °C per 30 secondi e 72 °C per 1 minuto e 20 secondi, seguiti da un'estensione di 5 minuti a 72 °C.
   2. Amplificare la sonda eubatterica utilizzando un frammento di DNA a 70 bp (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTGTCGTCAGCTGTGTGAATGTTGTTGTTAAGTCCCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCGCACACCCAACCC-3') sintetizzato come oligonucleotide e i seguenti primer: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' e 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. Eseguire amplificazioni con le seguenti condizioni di ciclo: 40 cicli a 94°C per 30 secondi, 60 °C per 30 secondi e 72 °C per 1 minuto e 20 secondi, seguiti da un'estensione di 5 minuti a 72 °C.
   3. Precipitare i prodotti PCR (≥500 μl) aggiungendo 3 M di acetato di sodio (pH 5,2) e etanolo al 100% (con un rapporto 10:1:2) e incubare a -20 °C per 2 ore.
   4. Centrifugare la miscela a 14.000 x g per 15 minuti, risospendere la pellet in 100 μl di acido tetraacetico Tris-etilendiaminaminato (EDTA) o tampone TE, e misurare la concentrazione di DNA tramite densità ottica a 260 nm.
2. Marcatura di digossigenina (DIG) utilizzando un kit di marcatura e rilevamento del DNA DIG
   1. Mescola 3 μg della sonda con acqua per un volume finale di 15 μl.
   2. Denatura il DNA a 95 °C per 10 minuti e raffredda rapidamente sul ghiaccio.
   3. Aggiungi 2 μl di 10x miscela esanucleotidi, 2 μl di miscela di marcatura disossinucleosidica trifosfato (dNTP) e 1 μl di enzima Klenow a 15 μl del DNA denaturato.
   4. Mescolare e incubare a 37 °C per 24 ore a 48 ore, fermando la reazione riscaldando a 65 °C.
3. Controlla la sensibilità della sonda marcata con DIG utilizzando un kit di marcatura e rilevamento del DNA DIG
   1. Caricare manualmente 1 μl di diluizioni seriali della sonda di controllo positiva fornita nel kit e 1 ng della sonda etichettata DIG sulla membrana in nylon e asciugare per 5 minuti a temperatura ambiente (RT).
   2. Immergi brevemente la membrana in 2x tampone salino-citrato di sodio (SSC) (0,3 M cloruro di sodio o NaCl, 30 mM citrato di sodio, pH 7,0) e incuba la membrana a 80 °C per 1 ora per immobilizzare il DNA.
   3. Immergi brevemente la membrana in un tampone di acido maleico (MAB, 0,1 M acido maleico, 0,15 M NaCl, pH 7,5) e incuba con anticorpi coniugati con fosfatasi alcaline (AP) anti-DIG diluito (1:5.000) in 6 ml di soluzione bloccante fornita nel kit a RT per 30 minuti.
   4. Lavare la membrana con MABT (MAB contenente 1% Tween 20) e applicare 40 μl della soluzione nitro-blu tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3'-indolilico fosfato (NBT/BCIP) miscelata con 2 ml di tampone di rilevamento (0,1 M tris(idrossimetil)aminometano cloridrato o Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M cloruro di magnesio o MgCl₂, pH 9,5) sulla membrana per 1 minuto. Se la sensibilità della sonda etichettata non è soddisfacente, ripetere i passaggi da 1.1.3 a 1.3.4.
   5. Misurare la concentrazione di DNA della sonda marcata (OD₂₆₀) e regolare la concentrazione a 100 ng μl-1.
4. Controlla la specificità della sonda etichettata DIG
   1. Denaturare i campioni di DNA genomico (25 ng 3 μl-1 per campione) di varie specie batteriche, incluso il batterio preso di mira dalla sonda specifica, a 95 °C per 10 minuti e raffreddarli rapidamente sul ghiaccio.
   2. Carica manualmente il DNA denaturato sulla membrana di nylon e asciuga per 20 minuti a RT.
   3. Immergi brevemente la membrana in 2x SSC buffer e incuba la membrana a 80 °C per 2 ore per immobilizzare il DNA.
   4. Blocca la membrana con una soluzione bloccante a RT per 1 ora.
   5. Diluire la sonda a 1 ng μl-1 nel buffer di ibridazione, denaturare le sonde diluite e applicarle sulla membrana.
   6. Incubare la membrana a 45 °C per 1 ora.
   7. Lava la membrana tre volte con 2 buffer SSC.
   8. Immergi brevemente la membrana nel MAB.
   9. Incubare con anticorpi anti-DIG coniugati AP diluiti (1:2.000) in 6 ml di soluzione bloccante a RT per 1 ora.
   10. Lavare la membrana con MABT e applicare 40 μl della soluzione NBT/BCIP mescolata con un tampone di rilevamento da 2 ml.
   11. Quando la sonda non raggiunge la specificità attesa, si aumenta la temperatura di ibridazione finché non si osserva la specificità.

2. Ibridazione in situ

Nota: Per evitare l'asciugatura di campioni e reagenti, esegui tutte le incubazioni in una camera umidificata foderata con carta assorbente bagnata.

1. Deparaffinizzazione e reidratazione delle sezioni tissutali
   1. Preparare sezioni di tessuto spesse 4 μm da blocchi incorporati in paraffina. Formalina, paraformaldeide e fissativo a base di zinco sono compatibili con questo protocollo.
   2. Prepara tutti i reagenti utilizzando acqua trattata con pirocarbonato dietilico (DEPC).
   3. Riscaldare in forno a 60 °C per 30 minuti e incubare i vetri a RT per 30 minuti.
   4. Immergi i vetrini nel 100% xilene per 5 minuti e tre volte; Usa xilene fresco ogni volta.
      Nota: Esegui questa procedura di deceratura in una cappa chimica.
   5. Immergi i vetrini in etanolo al 100% per 5 minuti due volte, usando etanolo fresco ogni volta, e reidrata i campioni in soluzioni seriali al 90%, 80% e 70% di etanolo per 5 minuti ciascuno.
   6. Immergi i vetri in acqua trattata con DEPC per 1 minuto e lava i vetri in soluzione salina tamponata con fosfato trattata con DEPC o PBS (pH 7,4) per 6 minuti.
2. Pretrattamenti delle sezioni tissutali
   1. Immergi i vetri in acido cloridrico a 0,1 N per 20 minuti e lava i vetri in acqua trattata con DEPC per 30 secondi.
   2. Disegna una barriera idrofoba che circonda i campioni usando una penna di cera.
      Nota: La dimensione della barriera idrofobica dipende dalla dimensione degli esemplari. Pertanto, i volumi di reagenti utilizzati nei passaggi seguenti variano a seconda della dimensione dei campioni, ma devono riempire la barriera idrofobica (50 μl per campioni piccoli e 400 μl per campioni grandi).
   3. Trattare i campioni con 50-400 μl di proteinasi K (da 1 a 10 μg ^ml-1 in PBS trattato con DEPC) in forno a secco a 37 °C per 30 minuti e lavare i vetri in 1x PBS trattato con DEPC per 1 minuto.
   4. Immollare le vetrine al 4% di paraformaldeide in PBS trattato con DEPC per 10 minuti, poi lavare le vetrine in PBS trattato con DEPC per 1 minuto.
   5. Immollare i vetri in 0,1 M trietanolammina-HCl (pH 8,0) contenente 0,5% di anidrido acetico per 20 minuti e lavare i vetri in acqua trattata con DEPC per 30 secondi.
3. Ibridazione con la sonda e lavaggio
   1. Immergi le slide in 2x SSC buffer per 20 minuti.
   2. Diluire la sonda a 1 ng ^μl-1 in un tampone di ibridazione (4x SSC, 50% [vol/vol] formamide, 1x soluzione di Denhardt, 10% [wt/vol] dextran solfato, 0,1% [wt/vol] dodecil solfato di sodio, 0,4 mg ml ml di DNA di spermatozoi di salmone). Per controlli negativi, si mescola la sonda marcata con una quantità di sonda non marcata di 10 volte in eccesso.
   3. Denatura le sonde diluite e applica da 50 a 400 μl sulle sezioni tissutali. Metti un antirobi di copertura sul carrello e sigillalo con lo smalto.
   4. Il calore viene trasferito nella macchina PCR a 90 °C per 10 minuti e incuba i vetri in una camera umidificata durante la notte (O/N) a 45 °C o temperatura ottimale determinata al passo 1.4.11.
   5. Raffreddare le vetrine a 4 °C per 30 minuti, rimuovere le scure di copertura e immergere le slide in un buffer SSC seriale come segue: 4 SSC per 10 minuti, pre-riscaldati (45 °C), 2 SSC per 20 minuti, 2 SSC per 10 minuti e 0,2 SSC per 10 minuti.
4. Rilevamento con anticorpi anti-DIG AP-coniugati
   1. Lava le slide in MABT per 5 minuti.
   2. Bloccare con 50-400 μl di soluzione bloccante con l'1% Tween 20 per 20 minuti.
   3. Aggiungere da 50 a 400 μl di anticorpi anti-DIG-AP diluiti in soluzione bloccante (1:1.000) e incubare a 37 °C per 90 minuti.
   4. Lava le slide in MABT per 10 minuti.
   5. Immergi le slide in un buffer di rilevamento contenente 1% Tween 20 per 5 minuti.
   6. Trattare con 50-400 μl di 1 mM levamisolo (in un tampone di rilevamento contenente 1% Tween 20) per 5 minuti per inattivare la fosfatasi alcalina endogena.
   7. Distribuire da 50 a 400 μl della soluzione NBT/BCIP premiscelata (diluita nel buffer di rilevamento a 1:100) su ciascun campione e incubare le vetrine in una camera umidificata a RT per 2-3 ore finché il segnale sviluppato non è soddisfacente.
   8. Risciacquare i vetri con acqua deionizzata per interrompere la visualizzazione e applicare 50-400 μl di verde metile allo 0,05% [peso/vol] come controcolorazione a 37 °C per 10 minuti.
   9. Risciacquare i vetrini con acqua deionizzata, disidratare in etanolo al 100% e immergersi nello xilene.
   10. Applica 80 μl di soluzione di montaggio su ogni carrello e coperchio con spallini di copertura.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anidride acetica	Sigma	6404
Soluzione di solfato di Dextrano al 50%	Millipore	S4030
La soluzione di 50X Denhardt	Sigma	D2532
Pirocarbonato dietilico (DEPC)	Sigma	P159220
Kit di marcatura e rilevamento del DNA per la digoxigenina (DIG)	Roche	11 093 657 910
Formamide	Sigma	F9037
Penna ImmEdge™	Dako	H-400
Levamisole	Vettore	SP-5000
Cloruro di magnesio	Sigma	246964
Acido maleico	Sigma	M0375
Verde di metile	Sigma	M6776
Paraformaldeide	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Soluzione di DNA di spermatozoi di salmone	Invitrogen	#15632-011
Cloruro di sodio	Sigma	S9625
Citrato di sodio	Duksan	D1420
Dodecilsolfato di sodio	Amresco	227
Trietanolammine-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Organici di ricerca	3098T