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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
Visualizzazione dell'infezione con bioluminescenza
- Per visualizzare la progressione dell'infezione, si inserisce un operone bioluminescente cromosomico (luxCDABE) nei ceppi PGN5 e VE2 di Pseudomonas aeruginosa testati. I plasmidi e il protocollo utilizzati per etichettare questi ceppi sono stati sviluppati nel laboratorio Schweizer e potrebbero non essere compatibili con tutte le specie/ceppi di batteri. È importante sottolineare che la visualizzazione dell'infezione è opzionale; Pertanto, l'inserimento genomico di questo operone non è necessario per eseguire lo studio sulla mortalità.
- Prepara e convalida i ceppi. Inoltre, verifica la bioluminescenza nei ceppi marcati ad ogni fase di validazione.
- Dopo aver preparato i ceppi, iniettare gli animali in gruppi di 10 con i ceppi bioluminescenti seguendo i passaggi sopra indicati.
- Immagini degli animali ogni 3 ore per 24 ore utilizzando un sistema di imaging animale capace di bioluminescenza.
- Per prima cosa, prepara l'imager impostando i parametri della telecamera e riscaldando il palco per gli animali. Poi, imposta il flusso di ossigeno a 1,5 L al minuto (oppure segui le raccomandazioni del produttore).
- Dopo che l'imager e lo stadio sono stati stabilizzati, inserire un topo nella camera di anestesia immediatamente dopo l'iniezione e somministrare isoflurano al 3,5% nella camera con flusso diO2 per circa 4 minuti. I metodi anestetici possono variare a seconda della camera e/o dell'agente anestetico utilizzato; Segui le raccomandazioni del produttore. Determina l'anestesia corretta tramite il test del riflesso di astinenza.
- Sposta il mouse sulla fase di stabilizzazione della temperatura. Posizionare il topo sulla schiena con le braccia distese e applicare un cono nasale per la somministrazione del 2,5% di isoflurano durante tutta la procedura di imaging.
- Chiudi la porta e scatta immagini bioluminescenti e raggi X del topo.
- Quando l'imaging è terminato, riporta il topo nella sua gabbia e monitoralo. Il topo dovrebbe riprendere conoscenza entro 3-5 minuti.
- Continua a fotografare i topi ogni 3 ore per 24 ore, ogni volta usando un mouse diverso di ogni gruppo. Non rifare le immagini di un topo entro 24 ore a causa della possibilità di effetti avversi derivanti da una nuova esposizione all'anestesia. Un singolo topo dovrebbe ricevere una sola dose di anestesia ogni 24-36 ore. Pulisci la piattaforma di imaging dopo ogni immagine del mouse. Spegni l'imager tra un momento e l'altro.
NOTA: La bioluminescenza svanirà, indipendentemente dal ceppo iniettato. L'intensità e la longevità della bioluminescenza variano a seconda di molti fattori, tra cui il numero di batteri iniettati, il ceppo di topo, il ceppo batterico, ecc.