Visualizzazione dell'infezione delle vie urinarie in un modello murino utilizzando la bioluminescenza

Abstract

Fonte: Luyts, N., et al. Follow-up longitudinale delle infezioni delle vie urinarie e il loro trattamento nei topi tramite imaging bioluminescenze. J. Vis. Esp. (2021).

Questo video dimostra l'induzione e il tracciamento dell'infezione delle vie urinarie in un modello murino utilizzando E. coli bioluminescente iniettate nella vescica, dove avvengono l'adesione, l'invasione e la replicazione intracellulare batterica. La luce emessa dall'operone bioluminescente funge da indicatore in tempo reale del carico batterico durante la progressione dell'infezione.

Protocollo

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Inoculazione degli animali

1. Preparazione degli animali
   1. Scegli il ceppo di topo desiderato in base alla domanda di ricerca e alla disponibilità di linee knock-out, ai dettagli sperimentali e alle differenze nella suscettibilità alle infezioni urinarie. Tieni presente che la cateterizzazione transuretrale è più facile nei topi femmine. Non utilizzare animali sotto le 8 settimane, poiché sono immunologicamente immaturi. Qui sono state utilizzate femmine di topi C57Bl/6J di 12 settimane.
   2. Ordina gli animali con largo anticipo e lasciali abituarsi, idealmente per 7 giorni. Accogliono gli animali in gabbie ventilate individualmente, in condizioni standard di 12 ore di luce e buio.
   3. Rasi la regione addominale degli animali per limitare la perdita di segnale. Non usare creme depilatorie, perché può bruciare rapidamente la pelle degli animali. Immobilizza l'animale tenendo strettamente la barba e gli arti posteriori con la mano non dominante mentre si rade con la mano dominante. In alternativa, radere sotto anestesia isoflurana.
      NOTA: Gli animali sono stati rasati 2 giorni prima dell'immagini, considerando che si toglieranno ancora di più la zona rasata.
   4. Fornisci acqua e cibo standard ad libitum durante tutto l'esperimento. Tuttavia, privare gli animali dell'acqua 2 ore prima dell'instillazione per minimizzare il volume della vescica durante l'instillazione.
   5. Montare una punta sterile da 24 G su una siringa da 100 μL e riempire la siringa con la soluzione batterica.
      NOTA: Per determinare la luminescenza di fondo, ottenere un'immagine di base prima dell'instillazione (vedi passo 2, sotto).
2. Instillazione degli animali
   1. Mettere gli animali in una camera di induzione e anestetizzare l'uso dell'inalazione di isoflurano con ossigeno puro come gas trasportatore (induzione al 3% e mantenimento all'1,5%).
   2. Posizionare un animale su una superficie di lavoro in posizione supina e mantenere un'anestesia isoflurana stabile usando un cono nasale durante l'instillazione. Applica la pomata per gli occhi.
   3. Espelle l'urina residua applicando una compressione delicata e muovendo circolari sulla regione suprapubica. Pulisci la parte bassa dell'addome con etanolo al 70% prima dell'instillazione.
   4. Lubrifica la punta del catetere con soluzione salina normale. Metti l'indice della mano non dominante sull'addome e spingilo delicatamente verso l'alto. Inizia la cateterizzazione dell'uretra con un angolo di 90° (verticalmente) e, una volta incontrata resistenza, inclinala orizzontalmente prima di inserirla ulteriormente (0,5 cm).
      NOTA: Non spingere mai con forza il catetere, perché questo causerebbe danni all'uretra. Movimenti di rotazione delicati possono essere utili nell'inserimento del catetere. D'altra parte, la mancanza di resistenza di solito indica un'inserimento errato nella vagina.
   5. Eseguire un'instillazione lenta (5 μL/s) di 50 μL dell'inoculo batterico (2 x 10⁷ CFU).
      NOTA: Volumi più alti o un'instillazione più rapida potrebbero causare reflusso ai reni. Durante la pratica della tecnica, l'inchiostro blu può essere utilizzato per valutare il reflusso.
   6. Dopo l'instillazione, tieni la siringa e il catetere in posizione per qualche secondo e poi ritrai lentamente per evitare perdite. Annota eventuali irregolarità come una grande perdita o un meato sanguinante ed escludi gli animali, se necessario.
   7. Posizionare l'animale in posizione supina al cono nasale della camera di imaging e ripetere i passaggi precedenti 1.1.1-1.1.6 per tutti gli animali rimanenti. Usa un catetere per ogni gruppo sperimentale. Assicurati che l'anestesia sia proseguita e riduci al minimo il tempo tra il primo e l'ultimo animale.
   8. Se necessario, somministrare antibiotici o farmaci sperimentali prima o dopo l'imaging (passo 2). Ad esempio, per somministrare enrofloxacina, aggiungere 40 μL della soluzione di enrofloxacina (100 mg/mL) a 3,96 mL di soluzione fisiologica per ottenere una diluizione 1/100. Iniettare 100 μL/10 g per via sottocutanea alle 9:00 e alle 17:00 per somministrare 10 mg/kg di enrofloxacina due volte al giorno per 3 giorni.

2. Imaging bioluminescenza

1. Preparazione e selezione dei parametri di imaging
   1. Apri il software di acquisizione BLI (vedi Tabella dei materiali) e clicca su Inizializzare nel dispositivo di imaging (vedi Tabella dei materiali) per testare la camera e il sistema di controller di palco e raffreddare la telecamera CCD a -90 °C.
      NOTA: Durante questo processo, la porta viene chiusa a chiave e il progresso dell'inizializzazione può essere seguito dal pannello di controllo. Una luce verde indica che è stata raggiunta la temperatura di -90 °C. Un avviso apparirà se si tenta l'imaging prima del completamento dell'inizializzazione.
   2. Assicurati che i dati vengano salvati automaticamente: clicca su acquisizione Salvataggio automatico e seleziona la cartella corretta.
   3. Seleziona Luminescence e fotografa. Controlla le impostazioni predefinite di luminescenza: imposta il filtro di eccitazione su Blocco e il filtro di emissione su Aperto.
   4. Imposta il tempo di esposizione su Auto quando scatti la prima immagine, specialmente quando si prevede un segnale fioco, per garantire un numero adeguato di fotoni. Per misurazioni in vivo e segnali luminosi, imposta il tempo di esposizione a ~30 s. Se l'immagine è satura, apparirà un avviso. Se succede, riduci il tempo di esposizione.
   5. Seleziona il Binning medio, F/stop 1, e scegli il campo visivo corretto (FOV) (D per 5 animali).
   6. Imposta l'altezza del soggetto a 1 cm quando si fanno immagini ai topi.
   7. Clicca su Aggiungi tre volte nel Pannello di Controllo Acquisizione per ottenere una sequenza di tre immagini, mentre tecnicamente si replica.
2. Imaging
   1. Posizionare i topi nella camera di imaging in posizione supina e utilizzare il cono nasale del manifold per mantenere l'anestesia (isoflurano 1,5%) durante tutto l'esperimento. Immagini fino a 5 topi contemporaneamente e separi gli animali usando il deflettore luminoso per evitare la riflessione.
   2. Chiudi la porta e clicca su Acquisisci per avviare la sequenza di immagini.
   3. Compila informazioni dettagliate sull'esperimento (animali selvatici e eliminatori, trattamenti, giorno dell'immagini, ecc.). Le impostazioni di immagini, come il tempo di esposizione, vengono salvate automaticamente.
   4. Rimuovi i topi dalla camera di imaging e riportali nella loro gabbia. Controlla la completa guarigione dopo l'anestesia. Nel giro di pochi minuti, gli animali dovrebbero essere completamente svegli ed esplorativi. Non fornire analgesia perché potrebbe interferire con il percorso delle infezioni urinarie.
   5. Riporta le gabbie ai rack ventilati fino al prossimo ciclo di imaging. Dopo il completamento dell'esperimento, si sopprimono gli animali tramite asfissia da_CO2 o lussazione cervicale. Fallo prima del recupero dell'anestesia isoflurana per minimizzare il disagio

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vaporizzatore per anestesia	Apparecchiatura Harvard limitata	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacina
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Angiocatetore giallo, usa una punta sterile in plastica per l'instillazione
Topi C57Bl/6J	Janvier	N/A
Centrifuga 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Laboratori Liberi	Trineo	per misurare OD 600nm
Soluzione salina tamponata a fosfato di Dulbecco, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Etanolo 70% denaturato 5L	VWR internazionale	85825360
Falcon 14ml tubo di polistirene con fondo rotondo, a scatto	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Siringa Hamilton GASTIGHT, blocco Luer in PTFE, 100 μL	Sigma-Aldrich	26203	per garantire una lenta instillazione batterica di 50 μL
Anello di inoculazione	Roth	6174.1	possessore: Arte. N. 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Prodotti Dechra Veterinary	N/A	Isoflurano
Sistema di imaging in vivo IVIS Spectrum	PerkinElmer	REF 124262	Dispositivo di imaging