Preparazione di colture di agrobatteri per la somministrazione di geni nelle cellule vegetali

Abstract

Fonte: Shi, J., et al., Screening e identificazione dei soppressori silenzianti dell'RNA da effettori secreti di patogeni vegetali. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video mostra la procedura per preparare una coltura di Agrobacterium tumefaciens inducendo l'espressione genica della virulenza con acetosirone, seguita dalla rimozione degli antibiotici tramite lavaggio e risospensione, per generare una sospensione pronta per la trasformazione destinata alla trasmissione genica nei tessuti vegetali.

Protocollo

1. Preparazione della coltura di Agrobacterium per l'infiltrazione

1. Scegli una colonia positiva dalla piastra di Luria-Bertani (LB) e inocula le cellule in un tubo di vetro contenente 5 mL di mezzo LB integrato con 50 μg/mL di kanamicina e 50 μg/mL di rifampicina. Fai crescere le cellule a 30 °C con agitazione a 200 giri/min per 24−48 ore.
2. Trasferire 100 μL di coltura in 5 mL di mezzo LB integrato con gli stessi antibiotici, 10 mM di 2-(N-morfolino) di acido etanosolfonico (MES; pH 5,6) e 20 μM acetosirone (AS). Coltiva i batteri a 30 °C con scuotimento a 200 giri/min per 16−20 ore.
3. Centrifuga le celle a 4.000 x g per 10 minuti. Versare via il sovrantato e risospendere il pellet in 2 mL di tampone da 10 mM di MgCl₂ .
4. Ripeti il passo 1.3 per garantire la completa rimozione degli antibiotici.
5. Determinare la densità della coltura di Agrobacterium misurando la densità ottica a 600 nm (OD_600). Regolare a un OD₆₀₀ di 1,5−2,0 con un buffer di 10 mM_{MgCl 2} .
6. Aggiungere 10 mM di MES (pH 5,6) e 150 μM di AS alle colture finali in sospensione e incubare le cellule a RT per almeno 3 ore senza scuotere.
   NOTA: Non lasciare le colture finali di sospensione durante la notte.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
2-Acido Morfolinoetanosulfonico (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
Acetosirone (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Induzione dell'Agrobatterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB medium
Bacto triptone	BD in Biologia	211705	LB medium
Estrazione di lievito bacto	BD in Biologia	212750	LB medium
Kanamicina solfato	Sigma-Aldrich	K1914	Antibiotici
Rifampicina	MP Biomedici	219549005	Antibiotici
Cloruro di sodio	Amresco	0241-10KG	LB medium