Preparazione del tessuto della vescica del topo per la visualizzazione di infezioni batteriche

Abstract

Fonte: O'Brien, V. P., et. al., Infezione urinaria ricorrente da Escherichia coli scatenata dall'esposizione alla vescica vaginale a Gardnerella vaginalis nei topi. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video dimostra l'uso della microscopia elettronica a scansione per visualizzare la colonizzazione batterica e le interazioni ospite-patogeno nell'epitelio vescicale, in un modello murino pre-infetto.

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.

1. Imaging delle vesciche tramite microscopia elettronica a scansione

   NOTA: Questa procedura può essere eseguita in qualsiasi momento in cui si desidera visualizzare l'urotelio. Come indicato nella Figura 1 (scatole viola), le interazioni uropatogene tra E. coli (UPEC) e uroteliale sono meglio visualizzate tra 6 e 24 ore dopo l'inoculazione UPEC durante la fase di formazione del serbatoio, e l'esfoliazione uroteliale innescata da Gardnerella vaginalis è meglio visualizzata tra 3 e 12 ore dopo la seconda esposizione a G. vaginalis .

   1. Fissazione della vescica in situ
      1. Prepara il fissativo immediatamente prima del prelievo della vescica aggiungendo glutaraldeide (2,5% finale) e paraformaldeide (2% finale) in un tampone cacodilato di sodio 0,15 M con 2 mM di_CaCl2 al pH 7,4. Usa paraformaldeide e glutaraldeide da fiale di vetro appena aperte, poiché entrambi i fissativi si ossidano nel tempo nei contenitori aperti. ATTENZIONE: Il glutaraldeide è tossico, un irritante respiratorio e corrosivo; Il paraformaldeide è infiammabile, cancerogeno, un irritante e una tossina riproduttiva; Il cacodilato di sodio è tossico e cancerogeno.
      2. Per produrre 50 mL di soluzione fissativa, aggiungere 6,25 mL di paraformaldeide al 16%, 2 mL di glutaraldeide al 50% e 16,75 mL di acqua ultrapura a 25 mL di una soluzione 0,3 M di cacodilato di sodio al pH 7,4 con 4 mM di_{CaCl 2}.
      3. Riscalda il fissativo preparato a 37 °C prima di somministrarlo alle vesciche.
      4. Riempire la siringa a punta scorrevole di tubercolina con un fissatore e fissare un catetere all'estremità, bisellato rivolto verso le marche opposte della siringa. Taglia il tubo in eccesso a 1-2 mm dalla punta dell'ago, facendo attenzione a non esporre la punta dell'ago. Scolpire la siringa per rimuovere le bolle e spingere lo sturalavandini per evacuare aria e riempire il catetere con un fissativo su un tubo microcentrifuga per raccogliere qualsiasi fissativo e smaltirlo correttamente.
      5. Anestetizzare e sacrificare il topo utilizzando un metodo approvato (ad esempio, lussazione cervicale sotto anestesia). Posiziona il topo sulla superficie dissezionale con le gambe fissate (con elastici o perni). Apri l'area pelvica del topo con le pinze e un paio di forbici chirurgiche per esporre la vescica. Sposta con attenzione il grasso adiacente ma lascia la vescica al suo posto.
      6. Tieni la siringa con la mano dominante, con l'ago rivolto verso il basso e la smussatura e i segni della siringa rivolti verso di te. Immergi la punta del catetere in un lubrificante sterile.
      7. Posizionare la punta del catetere all'apertura uretrale, tenendo la canna della siringa allontanata con un angolo di 30-45° sopra il corpo del topo.
      8. Applica una pressione verso il basso con un movimento molto piccolo in senso orario con la punta e inserisci delicatamente il catetere nell'uretra. Quando la punta del catetere entra nell'uretra, si inclina la siringa verso la coda del topo continuando a far scorrere il catetere più all'interno dell'uretra finché la canna della siringa non sarà parallela alla superficie di lavoro. L'intero fusto dell'ago del catetere (esclusa la base) dovrebbe entrare nel topo, posizionando la punta del catetere all'interno del lumen della vescica.
      9. Somministra lentamente 50-80 μL di fissativo, facendo gonfiare la vescica come un palloncino. Mantieni il catetere in posizione e solleva leggermente la siringa, inclinando la punta verso l'alto.
      10. Con l'altra mano, apri un emostato e fai scivolare un punto sotto l'ago del catetere all'incrocio dell'uretra. Chiudi parzialmente l'emostato finché non tocca appena l'ago.
      11. Fai scivolare delicatamente l'ago del catetere fuori dalla vescica mentre contemporaneamente si blocca e si blocca completamente l'emostat per evitare la perdita del fissativo.
      12. Impugna l'emostatico in modo che sia parallelo alla superficie di lavoro con la vescica appoggiata sopra. Solleva delicatamente e taglia con attenzione sotto l'emostato (lato opposto della vescica) per rimuovere la vescica con l'emostata ancora attaccata.
      13. Inserire la vescica e l'emostat attaccato in un tubo Falcon contenente il fissativo riscaldato. Assicurati che la vescica sia completamente immersa nel liquido e non premuta contro le pareti del tubo. Incubare a 4 °C per 24 ore.
   2. Elaborazione e imaging della vescica con microscopia elettronica a scansione (SEM)
      1. Sagittalmente taglia la vescica in due con una lametta pulita a doppia faccia e fai un secondo taglio tangenziale all'emostato per liberare la vescica. Questo porta a 2 "coppe" a mezza vescica. Se ci sono residui di cuscinetti grassi all'esterno della vescica, rimuovili delicatamente.
      2. Risciacquare le due due parti della vescica tre volte (10 min ciascuna) in tampone cacodilato di sodio (0,15 M, pH 7,4).
      3. Tingere il tessuto con tetrovido di osmio all'1% in un tampone cacodilato di 0,15 M per 1 ora a temperatura ambiente. L'osmio è sensibile alla luce; Pertanto, esegui questo passaggio con il recipiente di colorazione avvolto in alluminio per mantenere un ambiente buio. ​
         ATTENZIONE: Il tetrossido di osmio è tossico e corrosivo per la pelle. Fai questo passaggio nella cappa con i guanti.
      4. Risciacqua le metà della vescica tre volte (10 minuti ciascuna) in acqua ultrapura. Durante questi passaggi, a volte si può vedere olio osmicato sulla superficie dell'acqua. Aspira o svuota per evitare contaminazioni durante le fasi di asciugatura.
      5. Disidratano i tessuti immergendoli in una serie di etanolo classificato (50, 70, 90, 100 e 100%) per 10 minuti ciascuno.
      6. Asciuga il tessuto fisso usando un essiccatore a punto critico, eseguendo scambi di 12 CO₂ alla velocità più lenta. Imposta tutte le impostazioni aggiuntive su lento, tranne il passaggio di ventilazione, che è impostato su veloce.
      7. Taglia nuovamente a metà ogni vescica con un rasoio pulito a doppia faccia per generare un totale di 4 pezzi che riducono la curvatura del campione per un rivestimento più efficiente, facilita l'imaging nel SEM ed esporre i tessuti che potrebbero essersi arricciati durante l'asciugatura.
      8. Attacca i pezzi della vescica a una linguetta adesiva in carbonio conduttiva su un monello di alluminio e dipingi una piccola quantità di adesivo argentato intorno al contatto inferiore con uno stuzzicadente, facendo attenzione a evitare che l'eccesso di adesivo si accumuli sulla superficie interna della vescica.
      9. Usa un rivestimento a sputter ad alto vuoto per rivestire i mucchi di campione con 6 nm di iridio. Se i campioni continuano a caricarsi, assicurarsi che un percorso conduttivo sia dipinto fino alla superficie con vernice argentata e ricoprire con ulteriori 4 nm di iridio.
      10. Immagini i campioni con un microscopio elettronico a scansione. Sebbene le condizioni possano variare a seconda del microscopio utilizzato, una tensione di accelerazione di 3 KeV con una corrente di fascio di 200 pA e una distanza di lavoro di 12-13 mm funzionava bene su un Zeiss Merlin FE-SEM quando si utilizzava il rivelatore di elettroni Everhart-Thornley (SE2).

Results

Figura 1. Schema del modello del topo. La timeline viene evidenziata per riflettere le fasi o le procedure del modello descritto nel protocollo. Fase 1 (arancione): Stabilimento dei serbatoi intracellulari uropatogeni di E. coli (UPE...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G x 1/2 aghi	BD	305106	Per cateteri
Emostato a pinza dritta di 5 1/2"	McKesson	487377	Fissazione della vescica in situ
Rivestimento a sputatore ACE 600	Leica		Elaborazione dei campioni SEM
Stub SEM in alluminio	Ted Pella	16111	Elaborazione dei campioni SEM
Cloruro di calcio	EMS	12340	Fissazione della vescica in situ
Linguetta adesiva al carbonio conduttivo	Ted Pella	16084-1	Elaborazione dei campioni SEM
Vernice argentata conduttiva	Ted Pella	16034	Elaborazione dei campioni SEM
Asciugatrice Critica CPD 300	Leica		Elaborazione dei campioni SEM
Clip metallica a citofunnel	Simport	M964B	Analisi delle urine citospinate
Etanolo	EMS	15050	Elaborazione dei campioni SEM
Glucosio	Sigma	G7528	Per NYCIII G. vaginalis media di crescita
Glutaraldeide	EMS	16320	Fissazione della vescica in situ
Kit per la tintura Hema 3	Fisher	23123869	Analisi delle urine citospinate
HEPES	Cellgro	25-060-CL	Per NYCIII G. vaginalis media di crescita
Iridio	Ted Pella	91120	Elaborazione dei campioni SEM
Merlin FE-SEM	Zeiss		Microscopio elettronico a scansione
Purificatore d'acqua Milli-Q	Millipore	IQ-7000	Elaborazione dei campioni SEM
Tetrossido di osmio	EMS	19170	Elaborazione dei campioni SEM
Paraformaldeide	EMS	15710	Fissazione della vescica in situ
Tubi in polietilene	Intramedico	427401	per cateteri
Proteosa Peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	Per NYCIII G. vaginalis media di crescita
Lametta a doppio filo rivestita in PTFE	EMS	72000	Taglio delle vesciche per il SEM