Isolamento e coltivazione di batteri da embrioni di pesce zebra per valutare il carico infettivo

Abstract

Fonte: Bernut, A., et al., Decifrazione e imaging della patogenesi e cordaggio di Mycobacterium abscessus negli embrioni di pesce zebra. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra un protocollo per isolare e quantificare Mycobacterium abscessus da un embrione infetto di pesce zebra. La procedura prevede l'eutanasia embrionale, la lisi tissutale e l'omogeneizzazione per rilasciare i batteri, seguita da centrifugazione e risospensione in un tampone di tensioattivo. Infine, la sospensione batterica viene diluita serialmente, placcata su agar integrato con antibiotici e incubata per consentire la formazione e la quantificazione delle colonie.

Protocollo

Preparazione e conservazione dell'inoculo di M. abscessus
1. Condizioni di crescita di M. ascessus
  1. Placcare M. ascessus da una stocca glicerolica a -80°C su un agar Middlebrook 7H10 contenente il 10% di OADC e lo 0,5% di glicerolo (7H10OADc) e integrato con l'antibiotico appropriato a seconda del marcatore di resistenza trasportato dal vettore che codifica la proteina fluorescente. Incubare le piastre a 30 °C per 4-5 giorni.
  2. Prendi una colonia micobatterica fluorescente positiva e inocula 1 ml di brodo Middlebrook 7H9 integrato con OADC, 0,2% glicerolo, 0,05% Tween 80 (7H9OADc/T) con l'antibiotico necessario in un tubo plastico sterile da 15 ml. Incubare a 30 °C per 1 settimana senza tremare.
    NOTA: Tween 80 limita gli agglomeramenti e l'aggregazione batterica.
  3. Risospendere la pre-coltura ottenuta in 2,1,2 in 50 ml di Middlebrook 7H9OADc/T in fiaschette di coltura tessutale da 150 cm2 fino a un OD_{finale 0,1 600} (corrispondente a circa 5,107 batteri/ml) e incubare ulteriormente a 30 °C per 4 giorni per ottenere una coltura a crescita esponenziale (OD₆₀₀ = 0,6-0,8).
    NOTA: Per minimizzare gli agglomeri, specialmente della variante ruvida, l'incubazione non dovrebbe superare i 5 giorni. Sia le varianti lisce che quelle grezze mostrano un tasso di crescita simile.
Preparazione dell'inocula di M. abscessus
NOTA: A causa dell'elevata propensione dell'ascesso ruvido di M . a formare grandi aggregati e a produrre cordone, è necessario un trattamento specifico per generare inocoli omogenei e controllati quantitativamente prima delle microiniezioni negli embrioni. Questo trattamento viene applicato anche ai batteri lisci che producono aggregati, sebbene in misura minore rispetto al ceppo ruvido.
1. Prelevare colture a crescita esponenziale da fiaschette di coltura tessutale da 150 cm2 tramite centrifugazione a 4.000 x g per 15 minuti in RT in un tubo plastico sterile da 50 ml e risospendere il pellet batterico in 1 ml 7H9OADc/T. Aliquota 200 μl di sospensioni batteriche in tubi microcentrifughe da 1,5 ml.
  NOTA: Lavorare con piccoli volumi in siringhe da 1 ml è necessario per ottenere sospensioni altamente omogenee.
2. Omogeneizzare le sospensioni batteriche con un ago da 26 G (15 sequenze su e giù), sonicare tre volte per 10 secondi (con pause di 10 secondi tra ogni sequenza di sonicazione) usando un sonicatore a bagno d'acqua. Aggiungi 1 ml di 7H9OADc/T e crea un vortice breve. Centrifuga 3 minuti a 100 x g.
3. Raccogli con cura i soprantativi contenenti micobatteri per evitare i grumi e raccogli le sospensioni omogenee in un tubo di plastica sterile da 50 ml.
4. Controlla visivamente la presenza di aggregati batterici residui eventuali.
  NOTA: Se gli aggregati sono ancora presenti, procedere con un ulteriore passaggio di centrifugazione a 100 x g per 2 minuti e raccogliere il soprandante.
5. Centrifugare la sospensione a 4.000 x g per 5 minuti, risospendere il pellet a 200 μl 7H9OADc/T e procedere all'iniezione.
6. Valutare la concentrazione batterica finale impiegando diluizioni seriali (in 1x PBST) su agar 7H10OADc e contando le unità formative di colonie (CFU) dopo 4 giorni di incubazione a 30 °C. Le CFU dovrebbero essere determinate per ogni nuovo lotto.
7. Prepara le scorte di inocula congelate conservando 5 μl di aliquote a -80 °C.
  NOTA: La valutazione della CFU delle aliquote congelate a -80°C è un prerequisito per determinare il numero esatto di batteri vitali, poiché il congelamento/discongelamento può influire sulla vitalità batterica dell'inocolo. Questi inocula congelati sono pronti per essere utilizzati per le successive iniezioni. Poiché tutte le aliquote contengono lo stesso numero di CFU, permettono di iniettare batteri in modo riproducibile da un esperimento all'altro.
Controllo qualità dell'inoculo
NOTA: La colorazione Ziehl-Neelsen (specifica per i micobatteri) può essere utilizzata per confrontare la qualità delle sospensioni batteriche prima e dopo le procedure di omogeneizzazione.
1. Puntare e distribuire una goccia della sospensione batterica omogenea su un vetrino di vetro e lasciarla asciugare completamente. Fissa la spalmatura per almeno 30 minuti su una piastra calda impostata a 65-70 °C e tingi usando un protocollo di colorazione Ziehl-Neelsen.
2. Osserva il test batterico al microscopio usando un obiettivo 100X e confronta con un test di una sospensione batterica non processata (Figura 1).

2. Preparazione degli embrioni di pesce zebra

Riproduzione e raccolta delle uova di pesce zebra
1. Il giorno prima della deposizione, si riproducono i pesci zebra adulti mettendo 2 maschi e 1 femmina (di solito un rapporto di 2:1 consente il tasso ottimale di feconditazione) in una camera di riproduzione, composta da un acquario separato con un cesto per la raccolta delle uova.
  NOTA: I cesti per la raccolta delle uova vengono utilizzati per proteggere le uova dal mangiare dai genitori e facilitare la raccolta delle uova.
2. A 1 hpf, prelevare le uova e solo embrioni sviluppati correttamente in una piastra di Petri da 100 mm riempita con 25 ml di acqua di pesce blu (massimo 100 embrioni per piatto) e mantenerli a 28,5 °C. Le uova non fecondate vengono scartate.
Preparazione degli embrioni di pesce zebra per iniezioni
1. Circa 24 ore dopo la fecondazione (hpf), decorionare gli embrioni con pinzette fini in una piastra di Petri da 100 mm e mantenerli a 28,5 °C.
2. Raccogli i 30-48 embrioni di hpf usando una pipetta e trasferiscili in una camera di posizionamento a forma di "V" riempita con 25 ml di acqua di pesce contenente 270 mg/L di tricaina. Posiziona correttamente gli embrioni nei canali usando uno strumento a punta microloader fatto in casa (una punta microloader tagliata fatta in casa) ottimizzato per una micro-manipolazione più facile.
  NOTA: Orientare il lato dorsale verso il basso per le iniezioni endovenose nella vena caudale o il lato dorsale verso l'alto per le iniezioni del muscolo della coda.

3. Procedura di microiniezione

NOTA:. Per valutare la cronologia dell'infezione da M. abscessus (sopravvivenza, carichi batterici, cinetici e caratteristiche dell'infezione), si preferiscono iniezioni nella vena caudale di 30 embrioni di hpf. Per visualizzare il reclutamento delle cellule immunitarie, le iniezioni vengono effettuate in siti localizzati, come nei muscoli della coda di un embrione da 48 hpf.

Diluire l'inoculo micobatterico in 1X PBST (a seconda del numero di UFC da somministrare), contenente il 10% di fenolo rosso per verificare l'iniezione corretta.
Carica un ago di iniezione microcapillare con 5-10 μl dell'inoculo batterico usando una punta microcaricatrice, collega l'ago di microiniezione al supporto del micromanipolatore tridimensionale collegato all'iniettore e rompi la parte superiore dell'ago con pinzette sottili per ottenere un diametro di apertura di 5-10 μm.
Calibrare il volume di iniezione regolando la pressione di microiniezione (20-50 hPa) e il tempo (0,2 sec).
NOTA: Il volume di iniezione richiesto viene calibrato determinando visivamente il diametro di una goccia espulsa nel tuorlo di un embrione.
Per l'iniezione nella vena caudale, posiziona l'embrione con il lato ventrale rivolto verso l'ago e posiziona la punta dell'ago vicino all'apertura urogenitale, puntando alla vena caudale, e spingi delicatamente la punta dell'ago all'interno dell'embrione finché non perfora appena la regione della vena caudale. Somministrare il volume desiderato di preparazione batterica, solitamente 1-3 nl contenenti circa 100 CFU/nl.
Per l'iniezione intramuscolare, posizionare l'embrione con il lato dorsale rivolto verso l'ago, posizionare l'ago su un somite e iniettare un piccolo volume (1 nl) di inocolo.
NOTA: Per quanto riguarda le iniezioni nelle vene caudali, anche le iniezioni intramuscolari sono difficili da eseguire. Bisogna fare attenzione a evitare sovraccarichi, che potrebbe danneggiare i tessuti circostanti.
Al termine della procedura di iniezione, si controlla la dimensione dell'inoculo iniettando lo stesso volume di sospensione batterica in una goccia di PBST sterile, seguita dalla placcatura su 7H10OADc e contando la CFU. Circa 100 embrioni possono essere iniettati con un ago.
NOTA: Poiché l'ascesso di M . ruvido può continuare a formare aggregati nell'ago, le iniezioni devono essere effettuate immediatamente dopo la preparazione dell'inocolo.
Trasferire i pesci infetti individualmente su piastre a 24 pozzi contenenti 2 ml/pozzo di acqua per pesci e incubare a 28,5 °C. Gli embrioni iniettati con 1-3 nl 1X PBS possono essere utilizzati come controlli.
L'infezione corretta dei batteri fluorescenti negli embrioni viene monitorata tramite un microscopio a fluorescenza.

4. Quantificazione del carico batterico

Determinazione tramite enumerazione delle CFU
1. Al momento desiderato, raccogliere gruppi di embrioni infetti (5 per condizione) in tubi microcentrifuga da 1,5 ml (1 embrione/tubo), crio-anestetizzare gli embrioni incubandoli sul ghiaccio per 10 minuti e sopportare un'overdose di tricaina (300-500 mg/L)
2. Lava gli embrioni con acqua sterile due volte e dispensali in un nuovo tubo. Lisare ogni embrione con Triton X-100 al 2% diluito in 1X PBST utilizzando un ago da 26-G e omogeneizzare la sospensione fino alla lisi completa. Centrifuga la sospensione e risospensi il pellet in 1X PBST con 0,05% Tween 80. Le diluizioni seriali degli omogeneati vengono impiattate su Middlebrook 7H10OADc e integrate con BBL MGIT PANTA, come raccomandato dal fornitore.
  NOTA: M. ascessus è più suscettibile al trattamento NaOH rispetto a M. marinum. La decontaminazione dei lisati di pesci senza influenzare la crescita di M. abscessus può essere realizzata con successo utilizzando il cocktail antibiotico BBL MGIT PANTA.
3. Incubare le placche per 4 giorni a 30 °C e contare le colonie.

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Risultati

Figura 1. Preparazione dell'inocola dispersa di M. abscessus . Colorazione Ziehl-Neelsen delle varianti R o S coltivate su mezzo di brodo prima di qualsiasi trattamento (panel superiori) o dopo il trattamento (pa...