Modellazione della patogenesi di Aeromonas in C. elegans utilizzando un test di sopravvivenza

Abstract

Fonte: Chen, Y., et al. Valutazione della virulenza e della patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans . J. Vis. Esp. (2018)

Questo video mostra un test di sopravvivenza che utilizza C. elegans per modellare la patogenesi di Aeromonas , dove l'ingestione orale del batterio porta a infezioni intestinali e mortalità, consentendo una valutazione quantitativa della virulenza batterica in un sistema ospite vivo.

Protocollo

1. Saggio di sopravvivenza di C. elegans con Aeromonas

1. Il giorno della semina dei vermi L1 sul substrato di crescita del nematode arricchito (ENGM) che si diffondono con E. coli OP50, si sceglie una singola colonia di ciascuno dei quattro ceppi di Aeromonas o E. coli OP50 e coltura con brodo da 2 mL LB, rispettivamente, a 37 °C per 16 ore.
   NOTA: Per evitare contaminazioni, questo passaggio dovrebbe essere eseguito in una cappa a flusso laminare. Qui sono stati utilizzati i seguenti ceppi batterici: E. coli OP50, la fonte alimentare normale di C. elegans. A. dhakensis AAK1, il primo isolato clinico patogeno completamente sequenziato di A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 e A. caviae A2-9307121 sono isolati clinici rappresentativi provenienti dall'Ospedale Nazionale Universitario Cheng Kung.
2. Misurare l'assorbanza OD₆₀₀ (densità ottica a 600 nm) del brodo batterico e regolare il brodo batterico a OD₆₀₀ = 2,0 con LB brodo.
3. Spargere e spargere 30 μL di brodo batterico su ciascuna piastra di 6 cm di NMG (mezzo di crescita per nemanoidi). Coltiva le piastre a temperatura ambiente durante la notte.
   NOTA: Per preparare la NGM, scioglie 3 g di NaCl (cloruro di sodio), 2,5 g di peptone batterica e 20 g di agar in 1 litro di acqua deionizzata. Autoclave a 121 °C per 20 minuti. Aspettare che sia raffreddato a 55 °C in un bagno maria, poi aggiungere 1 mL di 1 M_{CaCl 2} (cloruro di calcio), 1 mL di 1 M_{MgSO 4} (solfato di magnesio), 1 mL di colesterolo al 5% in etanolo e 25 mL di tampone fosfato. Fai roteare per mescolare bene.
4. Il giorno in cui i vermi L1 crescono fino allo stadio L4, seleziona e trasferisci casualmente 50 vermi su una piastra NGM con ciascuno dei quattro ceppi di Aeromonas o E. coli OP50.
5. Incubare le piastre NGM a 20 °C fino al termine del saggio.
6. Trasferire tutti i vermi viventi su una lastra NGM appena preparata con batteri e contare ogni giorno il numero di vermi vivi, morti e sensori finché l'ultimo verme non è morto.
   NOTA: Trasferire i vermi su una piastra NGM fresca preparata ogni giorno per il mantenimento dell'infezione, anche se si utilizzano vermi sterili (ad esempio, glp-4 o con FudR).
7. Traccia le curve di sopravvivenza basandosi sul calcolo dei dati giornalieri.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incubatore shaker	YIH DER	LM-570R	Incubazione dei batteri
NaCl	SIGMA	31434	Preparazione del mezzo di coltura
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparazione del mezzo di coltura
Agar	Difco	214530	Preparazione del mezzo di coltura
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparazione del mezzo di coltura
Colesterolo	SIGMA	C8503	Preparazione del mezzo di coltura
Placca di Petri da 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparazione della piastra d'agar
Peptona batterica	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparazione del mezzo di coltura
FudR	SIGMA	1271008	Preparazione del mezzo di coltura
Sistema per microscopio	Nikon	Eclipasi Ti invertita	Imaging al microscopio