Il saggio descrive un modo rapido per misurare la rapida formazione di biofilm in batteri e funghi. Questo metodo utilizza una micropiastra come substrato per la formazione di biofilm microbico, e il biofilm viene visualizzato per mezzo viola ceppo di cristallo. Il saggio fornisce sia un test qualitativo o quantitativo per la formazione di biofilm presto.
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Articolo metodologico
Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione
In questo articolo
Sommario
Abstract
I biofilm sono comunità di microbi attaccati alle superfici, che si trova in campo medico, industriale e naturale. In realtà, la vita in un biofilm rappresenta probabilmente la modalità predominante di crescita per i microbi nella maggior parte degli ambienti. Biofilm mature hanno alcune caratteristiche distinte. Microbi biofilm sono in genere circondate da una matrice extracellulare che fornisce la struttura e la protezione per la comunità. I microbi che crescono in un biofilm hanno anche una caratteristica architettura generalmente costituiti da macrocolonies (contenente migliaia di cellule) circondato da piene di liquido canali. Biofilm cresciuto microbi sono anche noti per la loro resistenza a una vasta gamma di agenti antimicrobici, inclusi gli antibiotici clinicamente rilevanti.
Il test piatto micropiastra è uno strumento importante per lo studio delle prime fasi di formazione di biofilm, ed è stato applicato principalmente per lo studio dei biofilm batterici, anche se questo test è stato utilizzato anche per studiare la formazione di biofilm fungine. Poiché questo test utilizza statica, batch condizioni di crescita, non consentono la formazione di biofilm maturo tipicamente associati ai sistemi di cella di flusso. Tuttavia, il test si è dimostrato efficace a individuare molti fattori necessari per l'inizio della formazione di biofilm (cioè, flagelli, pili, adesine, enzimi coinvolti nella ciclico-di-GMP vincolanti e metabolismo) e così come i geni coinvolti nella produzione di polisaccaridi extracellulari. Inoltre, opera pubblicata indica che i biofilm cresciuto in piatti microtitolazione si sviluppano alcune proprietà di biofilm maturo, una tale tolleranza agli antibiotici e la resistenza alle effettori del sistema immunitario.
Questo semplice test piatto microtitolazione consente la formazione di un biofilm sulla parete e / o fondo di un piatto di microtitolazione. La natura elevato throughput del test lo rende utile per schermi genetico, così come la formazione di biofilm test da ceppi diversi, in condizioni di crescita diverse. Le varianti di questo test sono stati utilizzati per valutare la formazione di biofilm presto per una grande varietà di microbi, inclusi ma non limitati a, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococchi, micobatteri e funghi.
Nel protocollo qui descritto, ci concentreremo sull'uso di questo test per studiare la formazione di biofilm da Pseudomonas aeruginosa organismo modello. In questo saggio, l'estensione della formazione di biofilm è misurata utilizzando il colorante cristal violetto (CV). Tuttavia, una serie di altre macchie colorimetriche e metabolici sono stati segnalati per la quantificazione della formazione di biofilm utilizzando il test micropiastra. L', facilità a basso costo e flessibilità del dosaggio micropiastra ha reso uno strumento fondamentale per lo studio dei biofilm.
Protocollo
1. Crescita di un biofilm
- Crescere una cultura della wild-type Pseudomonas aeruginosa o ceppo mutante durante la notte in un terreno ricco (LB cioè)
- Diluire gli oltre 1:100 cultura notte in mezzo fresco per saggi biofilm. Uno standard dosaggio medio biofilm per P. aeruginosa è M63 terreno minimo integrato con solfato di magnesio, glucosio e acidi casamino (vedi tabella). In alternativa biofilm promuovere mezzo che stimola la crescita planctonici meno e un biofilm più robusto, il glucosio e acidi casamino può essere sostituito con arginina come il carbonio e unica fonte di energia.
- Aggiungere 100 microlitri della diluiz....
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Discussione
Questo metodo può essere modificato per essere utilizzato con una grande varietà di specie microbiche. Microbi mobili tipicamente aderire alle pareti e / o fondo dei pozzi, mentre non mobili microbi tipicamente aderire al fondo dei pozzetti. Le condizioni ottimali per la formazione di biofilm (cioè, terreno di coltura, temperatura, tempo di incubazione) devono essere determinati empiricamente per ogni microbo. Vi consiglio l'esecuzione di più repliche per ogni ceppo o condizione (4-8), e tra un controllo positivo e,.......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
I miei ringraziamenti a Sherry Kuchma, Pete Newell e Robert Shanks per aver fornito le immagini in Figura 1. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere R01AI083256 al GAO
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1 X M63 | Preparare una soluzione madre 5X di M63 sciogliendo 15 g di KH2PO4, 35 g di K2HPO4 e 10 g di (NH4)2SO4 in 1 L di acqua. Questa soluzione madre d–non necessita di autoclave e può essere conservato a temperatura ambiente. Diluire il stock 5X in rapporto 1:5, autoclavare, raffreddare, quindi aggiungere i componenti desiderati. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Solfato di magnesio | Fisher Scientific | M63-500 | Aggiungere fino a una concentrazione finale di 1 mM. Preparare una soluzione madre al 1 M in acqua e sterilizzare in autoclave. |
| Glucosio | Fisher Scientific | D16-3 | Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,2%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare in autoclave. |
| Casaminoacidi | BD Biosciences | 223050 | Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,5%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare in autoclave. |
| Arginina | Sigma-Aldrich | A5131 | Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,4%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare per filtrazione. Questa fonte alternativa di carbonio/energia può sostituire glucosio e acidi casaminoici |
| Piastre a microtitolazione | BD Biosciences | 353911 | Piastra per saggi Falcon 3911, Microtest III, flessibile, 96 pozzetti, fondo rotondo, non sterile, non trattata per colture cellulari. |
| Coperchi per piastre a microtitolazione | BD Biosciences | 353913 | I coperchi possono essere riutilizzati pulendoli con etanolo al 95% in acqua. |
| Violetto cristallo | Sigma-Aldrich | 229641000 | Preparare una soluzione allo 0,1% in acqua. |
Riferimenti
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle....
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Ristampe e permessi
