Microtitolazione Dish Biofilm saggio Formazione

Sommario

Il saggio descrive un modo rapido per misurare la rapida formazione di biofilm in batteri e funghi. Questo metodo utilizza una micropiastra come substrato per la formazione di biofilm microbico, e il biofilm viene visualizzato per mezzo viola ceppo di cristallo. Il saggio fornisce sia un test qualitativo o quantitativo per la formazione di biofilm presto.

Abstract

I biofilm sono comunità di microbi attaccati alle superfici, che si trova in campo medico, industriale e naturale. In realtà, la vita in un biofilm rappresenta probabilmente la modalità predominante di crescita per i microbi nella maggior parte degli ambienti. Biofilm mature hanno alcune caratteristiche distinte. Microbi biofilm sono in genere circondate da una matrice extracellulare che fornisce la struttura e la protezione per la comunità. I microbi che crescono in un biofilm hanno anche una caratteristica architettura generalmente costituiti da macrocolonies (contenente migliaia di cellule) circondato da piene di liquido canali. Biofilm cresciuto microbi sono anche noti per la loro resistenza a una vasta gamma di agenti antimicrobici, inclusi gli antibiotici clinicamente rilevanti.

Il test piatto micropiastra è uno strumento importante per lo studio delle prime fasi di formazione di biofilm, ed è stato applicato principalmente per lo studio dei biofilm batterici, anche se questo test è stato utilizzato anche per studiare la formazione di biofilm fungine. Poiché questo test utilizza statica, batch condizioni di crescita, non consentono la formazione di biofilm maturo tipicamente associati ai sistemi di cella di flusso. Tuttavia, il test si è dimostrato efficace a individuare molti fattori necessari per l'inizio della formazione di biofilm (cioè, flagelli, pili, adesine, enzimi coinvolti nella ciclico-di-GMP vincolanti e metabolismo) e così come i geni coinvolti nella produzione di polisaccaridi extracellulari. Inoltre, opera pubblicata indica che i biofilm cresciuto in piatti microtitolazione si sviluppano alcune proprietà di biofilm maturo, una tale tolleranza agli antibiotici e la resistenza alle effettori del sistema immunitario.

Questo semplice test piatto microtitolazione consente la formazione di un biofilm sulla parete e / o fondo di un piatto di microtitolazione. La natura elevato throughput del test lo rende utile per schermi genetico, così come la formazione di biofilm test da ceppi diversi, in condizioni di crescita diverse. Le varianti di questo test sono stati utilizzati per valutare la formazione di biofilm presto per una grande varietà di microbi, inclusi ma non limitati a, Pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococchi, micobatteri e funghi.

Nel protocollo qui descritto, ci concentreremo sull'uso di questo test per studiare la formazione di biofilm da Pseudomonas aeruginosa organismo modello. In questo saggio, l'estensione della formazione di biofilm è misurata utilizzando il colorante cristal violetto (CV). Tuttavia, una serie di altre macchie colorimetriche e metabolici sono stati segnalati per la quantificazione della formazione di biofilm utilizzando il test micropiastra. L', facilità a basso costo e flessibilità del dosaggio micropiastra ha reso uno strumento fondamentale per lo studio dei biofilm.

Protocollo

1. Crescita di un biofilm

1. Crescere una cultura della wild-type Pseudomonas aeruginosa o ceppo mutante durante la notte in un terreno ricco (LB cioè)
2. Diluire gli oltre 1:100 cultura notte in mezzo fresco per saggi biofilm. Uno standard dosaggio medio biofilm per P. aeruginosa è M63 terreno minimo integrato con solfato di magnesio, glucosio e acidi casamino (vedi tabella). In alternativa biofilm promuovere mezzo che stimola la crescita planctonici meno e un biofilm più robusto, il glucosio e acidi casamino può essere sostituito con arginina come il carbonio e unica fonte di energia.
3. Aggiungere 100 microlitri della diluizione per bene in un piatto da 96 pozzetti. Per le analisi quantitative, di solito uso pozzi 4-8 repliche per ogni trattamento.
4. Incubare la micropiastra per 4-24 ore a 37 ° C.

2. La colorazione del biofilm

1. Dopo l'incubazione, le cellule discarica ruotando la piastra su e scuotendo il liquido.
2. Immergere delicatamente la piastra in una vasca d'acqua (ad esempio, utilizzare il fondo delle scatole pipetta punta per P1000 pipetmen come la vasca). Vuotare l'acqua. Ripetere la procedura una seconda volta. Questo passaggio consente di rimuovere le cellule distaccato e componenti multimediali che possono essere colorati nel passaggio successivo, e riduce in modo significativo la colorazione di fondo.
3. Aggiungere 125 ml di una soluzione 0,1% del cristalvioletto in acqua per ciascun pozzetto della micropiastra. Indossare guanti ed un camice da laboratorio rendendo la soluzione. Prestare attenzione nel valutare i CV come la polvere igroscopici e facilmente le macchie abbigliamento, pelle, ecc
4. Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 10-15 min.
5. Risciacquare più volte il piatto 3-4 con l'acqua immergendo in una vasca di acqua come sopra, scuotere vigorosamente e asciugare su una pila di carta assorbente per eliminare la placca di tutte le cellule in eccesso e tintura.
6. Girare la micropiastra capovolta e secco per alcune ore o durante la notte.
7. Per le analisi qualitative, i pozzetti possono essere fotografati a secco.

3. Quantificare il biofilm

1. Aggiungere 125 ml di 30% di acido acetico in acqua in ciascun pozzetto della piastra di microtitolazione per solubilizzare il CV.
2. Incubare la micropiastra a temperatura ambiente per 10-15 min.
3. Trasferire 125 microlitri della CV solubilizzato a un nuovo fondo piatto piatto microtitolazione.
4. Quantificare assorbanza in un lettore di piastre a 550 nm con 30% di acido acetico in acqua come il vuoto.

4. Rappresentante dei risultati:

Figura 1. Evidenzia un risultato rappresentativo per i test eseguiti per la formazione di biofilm Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens e Staphylococcus aureus. (A) Una vista laterale del bene con un biofilm di P. aeruginosa (8 ore, 37 ° C). (B) Una vista laterale del bene con un biofilm di P. fluorescens (6 ore, 30 ° C). (C) Un top-down vista del biofilm formato da S. aureus in un piatto fondo micropiastra (due pozzi, 24 ore, 37 ° C). P. aeruginosa e P. fluorescens sono entrambi organismi mobili e formano un biofilm all'interfaccia aria-liquido. S. aureus è non-mobili e forma un biofilm sul fondo del pozzo.

Discussione

Questo metodo può essere modificato per essere utilizzato con una grande varietà di specie microbiche. Microbi mobili tipicamente aderire alle pareti e / o fondo dei pozzi, mentre non mobili microbi tipicamente aderire al fondo dei pozzetti. Le condizioni ottimali per la formazione di biofilm (cioè, terreno di coltura, temperatura, tempo di incubazione) devono essere determinati empiricamente per ogni microbo. Vi consiglio l'esecuzione di più repliche per ogni ceppo o condizione (4-8), e tra un controllo positivo e,...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
1 X M63			Preparare una soluzione madre 5X di M63 sciogliendo 15 g di KH2PO4, 35 g di K2HPO4 e 10 g di (NH4)2SO4 in 1 L di acqua. Questa soluzione madre d–non necessita di autoclave e può essere conservato a temperatura ambiente. Diluire il stock 5X in rapporto 1:5, autoclavare, raffreddare, quindi aggiungere i componenti desiderati.
KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
K2HPO4	Fisher Scientific	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma-Aldrich	A5132
Solfato di magnesio	Fisher Scientific	M63-500	Aggiungere fino a una concentrazione finale di 1 mM. Preparare una soluzione madre al 1 M in acqua e sterilizzare in autoclave.
Glucosio	Fisher Scientific	D16-3	Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,2%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare in autoclave.
Casaminoacidi	BD Biosciences	223050	Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,5%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare in autoclave.
Arginina	Sigma-Aldrich	A5131	Aggiungere fino a una concentrazione finale dello 0,4%. Preparare una soluzione madre al 20% in acqua e sterilizzare per filtrazione. Questa fonte alternativa di carbonio/energia può sostituire glucosio e acidi casaminoici
Piastre a microtitolazione	BD Biosciences	353911	Piastra per saggi Falcon 3911, Microtest III, flessibile, 96 pozzetti, fondo rotondo, non sterile, non trattata per colture cellulari.
Coperchi per piastre a microtitolazione	BD Biosciences	353913	I coperchi possono essere riutilizzati pulendoli con etanolo al 95% in acqua.
Violetto cristallo	Sigma-Aldrich	229641000	Preparare una soluzione allo 0,1% in acqua.