Valutazione della virulenza batterica utilizzando il test di tossicità liquida di C. elegans

Abstract

Fonte: Chen, Y., et al. Valutazione della virulenza e della patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans. J. Vis. Esp. (2018).

Questo video mostra il Saggio di Tossicità Liquida di C. elegans con Aeromonas, un metodo utilizzato per valutare la virulenza batterica misurando la sopravvivenza dei vermi in un ambiente liquido a basso contenuto di nutrienti. Il saggio rivela patogenicità specifica del ceppo basata sull'entità del danno indotto dalla tossina e sulla mortalità in C. elegans.

Protocol

1. Saggio di tossicità liquida di C. elegans con Aeromonas

NOTA: Per evitare contaminazioni, si devono eseguire i passaggi in una cappa a flusso laminare.

1. Il giorno dopo la semina dei vermi L1 sulla piastra ENGM (Enhanced Nematoid Growth Medium) distribuita con E. coli OP50, si seleziona una singola colonia di ciascuno dei quattro ceppi di Aeromonas e di E. coli OP50, e si coltura con 5 mL di brodo da 5 mL ciascuno a 37 °C per 16 ore.
   NOTA: Nel protocollo sono stati utilizzati i seguenti ceppi batterici: E. coli OP50, la fonte alimentare normale di C. elegans. A. dhakensis AAK1, il primo isolato clinico patogeno completamente sequenziato di A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 e A. caviae A2-9307121 sono isolati clinici rappresentativi provenienti dall'Ospedale Universitario Nazionale Cheng Kung.  
   NOTA: Per preparare NGM arricchito (ENGM), sciogliere 3 g di NaCl, 5 g di peptone batterica, 1 g di estratto di lievito e 30 g di agar in 1 L di acqua deionizzata. Autoclave a 121 °C per 20 minuti. Attendi che sia raffreddato a 55 °C in un bagno d'acqua e aggiungi 1 mL di 1 M CaCl₂, 1 mL di 1 M_{MgSO 4}, 1 mL di colesterolo al 5% in etanolo e 25 mL di fosfato tampon. Fai roteare per mescolare bene.
2. Misura l'assorbanza OD₆₀₀ del brodo batterico.
3. Centrifuga il brodo batterico a 3.500 x g per 15 minuti per rimuovere il brodo LB. Risospensi i batteri e regola il brodo batterico a OD₆₀₀ = 3.0 con mezzo S. Aggiungi 195 μL di brodo batterico in mezzo S ad almeno 8 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti.
   NOTA: Composizione del mezzo S: Per preparare il mezzo S, miscelare 40 mL di S basale, 0,4 mL di citrato di potassio 1M, 0,4 mL di soluzione di metalli traccia, 0,12 mL di 1 M CaCl₂, 0,12 mL di 1 M_{MgSO 4}, 40 μL di colesterolo al 5% in etanolo e 1 mL di 8 mM FudR prima dell'uso.
4. Lava via i vermi L4 sulla piastra ENGM con E. coli OP5 usando mezzo M9. Regolare la soluzione di verme a una concentrazione di 5 vermi per μL e aggiungere 5 μL di soluzione di verme a ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzi. Assicurati che ci siano circa 25 vermi per pozzo.
5. Incubare la piastra da 96 pozzi su uno shaker a 200 giri/min a 25 °C.
6. Contare il numero di vermi vivi e morti dopo 24, 48 e 72 ore. Calcola i tassi di sopravvivenza di ogni pozzo con la seguente formula: (vermi vivi/Vermi totali) × 100%.
7. Disegna un grafico a scatter con il calcolo dei dati giornalieri.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Incubatore shaker	YIH DER	LM-570R	Incubazione dei batteri
NaCl	SIGMA	31434	Preparazione del mezzo di coltura
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparazione del mezzo di coltura
Agar	Difco	214530	Preparazione del mezzo di coltura
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparazione del mezzo di coltura
Colesterolo	SIGMA	C8503	Preparazione del mezzo di coltura
Etanolo	SIGMA	32205	Preparazione del mezzo di coltura
KOH	SIGMA	P5958	Preparazione del mezzo di coltura
Placca di Petri da 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparazione della piastra di agar
Piastra a 96 pozzi	FALCON	353072	Analisi liquida
Peptona batterica	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparazione del mezzo di coltura
Estratto di lievito	SIGMA	92144	Preparazione del mezzo di coltura
Acido citrico•H₂O	SIGMA	C1909	Preparazione del mezzo di coltura
Tri-potassio citrato•H₂O	SIGMA	104956	Preparazione del mezzo di coltura
FudR	SIGMA	1271008	Preparazione del mezzo di coltura
EDTA disodico	SIGMA	E1644	Preparazione del mezzo di coltura
Triptone	SIGMA	16922	Preparazione del mezzo di coltura
Sistema per microscopio	Nikon	Eclipasi Ti invertita	Imaging microscopico
Fotocamera CCD scientifica	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Imaging microscopico