Test di necrosi muscolare in C. elegans indotto da un ceppo patogeno di Aeromonas

Abstract

Fonte: Chen, Y. et al., Valutazione della virulenza e patogenesi dell'infezione da Aeromonas in un modello di Caenorhabditis elegans . J. Vis. Esp. (2018)

Questo video mostra un saggio di necrosi muscolare su C. elegans (Caenorhabditis elegans) utilizzando ceppi patogeni di Aeromonas . Alimentando vermi che esprimono proteine fluorescenti verdi (GFP) su piastre con Aeromonas, il saggio modella l'infezione batterica e rivela danni tissutali tramite immagini a fluorescenza. La progressiva perdita della struttura muscolare e del segnale GFP indica una risposta necrotica indotta da Aeromonas.

Protocollo

1. Saggio di necrosi muscolare con Aeromonas

NOTA: Per evitare contaminazioni, questi passaggi devono essere eseguiti in una cappa a flusso laminare.

1. Il giorno in cui i vermi L1 vengono seminati sul mezzo di crescita del nematode arricchito (ENGM) distribuito con Escherichia coli OP50, si sceglie una singola colonia di ciascuno dei quattro ceppi di Aeromonas e E. coli OP50 e coltura con 2 mL di brodo Luria-Bertani (LB) ciascuno a 37 °C per 16 ore. NOTA: Qui sono stati utilizzati i seguenti ceppi batterici: E. coli OP50, la fonte alimentare normale di C. elegans. A. dhakensis AAK1, il primo isolato clinico patogeno completamente sequenziato di A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 e A. caviae A2-9307121 sono isolati clinici rappresentativi provenienti dall'Ospedale Nazionale Universitario Cheng Kung.
2. Misura l'assorbanza OD₆₀₀ del brodo batterico e regola il brodo batterico a OD₆₀₀ = 2.0 con LB brodo. Individuare e distribuire 30 μL di brodo batterico su piastre di mezzo di crescita nematode (NGM) di 6 cm. Coltiva le piastre a temperatura ambiente durante la notte.
3. Il giorno in cui i vermi L1 crescono fino allo stadio L4, trasferire 50 vermi su ciascuna piastra NGM con ciascuno dei quattro ceppi di Aeromonas o E. coli OP50. Incubare le placche NGM a 20 °C. Trasferire i vermi ogni 24 ore su placche NGM appena preparate con batteri.
4. Scatta immagini muscolari usando un microscopio a fluorescenza.
   1. Scegli casualmente 10 vermi su un gel di agarosio al 2% in mezzo M9 su un vetrino. Paralizza i vermi usando 2 μL di azide di sodio all'1% in mezzo M9 su agarosio per meno di 5 minuti prima di scattare le immagini.
   2. Posizionare un copricapo e catturare le immagini muscolari utilizzando un filtro a proteina fluorescente verde (GFP) su un microscopio fluorescente con fotocamera a dispositivo a carico accoppiato. Scatta le immagini muscolari a 24, 48 e 72 ore dopo la fase L4.

Effettua analisi delle immagini e preparazione delle figure con un software di elaborazione delle immagini.
NOTA: Le definizioni dei punteggi e dei livelli di danno muscolare sono mostrate nella Figura 1, per la quale i criteri sono elencati come segue: 3 punti per la mancanza di fibre muscolari; 2 punti per fibre muscolari rotte o rotte; 1 punto per le fibre muscolari piegate; 0 punti per fibre muscolari sane.

Risultati

Figura 1: I corrispondenti punteggi per la necrosi muscolare in C. elegans indotta dall'infezione da Aeromonas. I criteri per la necrosi muscolare e i punteggi corrispond...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Incubatore shaker	YIH DER	LM-570R	Incubazione dei batteri
K₂HPO₄	J.T. Baker	MP021519455	Preparazione del mezzo di coltura
KH₂PO₄	J.T. Baker	3246-05	Preparazione del mezzo di coltura
Na₂HPO₄	J.T. Baker	MP021914405	Preparazione del mezzo di coltura
NaCl	SIGMA	31434	Preparazione del mezzo di coltura
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparazione del mezzo di coltura
Agar	Difco	214530	Preparazione del mezzo di coltura
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparazione del mezzo di coltura
Colesterolo	SIGMA	C8503	Preparazione del mezzo di coltura
Etanolo	SIGMA	32205	Preparazione del mezzo di coltura
KOH	SIGMA	P5958	Preparazione del mezzo di coltura
Placca di Petri da 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparazione della piastra d'agar
Peptona batterica	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparazione del mezzo di coltura
Estratto di lievito	SIGMA	92144	Preparazione del mezzo di coltura
Acido citrico•H₂O	SIGMA	C1909	Preparazione del mezzo di coltura
Tri-potassio citrato•H₂O	SIGMA	104956	Preparazione del mezzo di coltura
FudR	SIGMA	1271008	Preparazione del mezzo di coltura
EDTA disodico	SIGMA	E1644	Preparazione del mezzo di coltura
FeSO₄·7H₂O	SIGMA	215422	Preparazione del mezzo di coltura
MnCl₂·4H₂O	SIGMA	221279	Preparazione del mezzo di coltura
ZnSO₄·7H₂O	SIGMA	204986	Preparazione del mezzo di coltura
CuSO₄·5H₂O	SIGMA	C8027	Preparazione del mezzo di coltura
Triptone	SIGMA	16922	Preparazione del mezzo di coltura
Sistema per microscopio	Nikon	Eclipasi Ti invertita	Imaging al microscopio
Fotocamera CCD scientifica	QImaging	Retiga-2000R Fast 1394	Imaging al microscopio