Stabilizzazione mediata da fibre di curli dei modelli idrogel batterici

Abstract

Fonte: Spiesz, E. M., et al., Patterning tridimensionale di biofilm ingegnerizzati con un biostampante fai-da-te. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video dimostra un metodo per confrontare pattern alginati stampati in 3D contenenti ceppi batterici di controllo o geneticamente modificati. La ceppa di prova produce fibre curli all'induzione, che rafforzano la struttura dell'alginato idrogel. Dopo il trattamento con una soluzione chelante del calcio, rimane intatto solo il modello di test, evidenziando l'effetto stabilizzante della produzione di fibre di riccolo.

Protocollo

1. 3D processo di stampa

1. Installa e apri il software di stampa 3D (Table of Materials) su un computer. Collega la stampante 3D al computer. Sposta la testina di stampa nella sua posizione principale cliccando sul pulsante home per gli assi X, Y e Z.
2. Per ogni stampa, posizionare un substrato di stampa preparato in una posizione specifica del piano di stampa.
3. Calibra l'altezza della testina di stampa sull'asse Z.
   1. Alza la testina di stampa a un'altezza di 22 mm sotto controllo manuale, così da non scontrare il bordo della piastra di Petri quando si sposta nella posizione desiderata. Posiziona la testina sopra la lastra e spostala verso il basso finché la punta della pipetta non tocca la superficie di stampa. Assegna questa posizione sull'asse Z come Z1 (l'altezza della superficie di stampa).
   2. Alza la testina di stampa e spostala fuori dall'area della piastra controllando manualmente gli assi X, Y e Z. Se la distanza di lavoro tra la testina e la superficie della lastra è definita come Z2, inserire Z1 + Z2 nel programma di stampa come valore Z durante la stampa.
4. Programmare la forma di stampa con un metodo auto-sviluppato punto per punto e determinato dalle coordinate secondo la traiettoria desiderata.
   1. Se la traiettoria desiderata è una linea retta, definisci solo i punti di inizio e fine. Includere punti aggiuntivi sulle linee curve porterà a curve più morbide. Sposta manualmente la testina di stampa su ogni punto in modo sequenziale e registra le coordinate di questi punti in ordine. Inserisci tutte queste coordinate così come la velocità di movimento della testina di stampa per ogni segmento stampato nell'editor di G-code.
5. Sia prima che dopo la stampa, sollevare la testina di stampa a una distanza superiore al bordo della lastra (20 mm) e spostarsi direttamente fuori dalla regione della lastre. Salva questo programma come file G-code e caricalo direttamente per l'uso nelle stampe successive, mentre rimisura l'altezza dell'asse Z per ogni nuovo supporto di stampa.
   NOTA: Vedi la Tabella 1 per un esempio di G-code per la stampa di un quadrato.
6. Carica il file G-code preprogrammato. Apri l'editor di G-code nel software e programma i comandi per stampare la forma desiderata. Ad ogni riga di comando, la posizione della testina di stampa può essere modificata sugli assi X, Y e/o Z. Inserisci il valore Z durante tutte le fasi di stampa come Z1 + Z2 (altezza della superficie di stampa + distanza di lavoro).
   NOTA: Anche la velocità di movimento è regolabile; 9.000 mm/min è un valore adatto per le tipiche velocità di stampa.
7. Carica l'inchiostro bio-liquido nella siringa o nelle sirighe e montali nella pompa della siringa della biostampante 3D.
8. Stampare il bio-inchiostro sul substrato di stampa cliccando sul pulsante Stampa.
9. Durante la stampa, controlla completamente il movimento della testina tramite il software. Avvia manualmente la pompa della siringa prima che la testina entri in contatto con la superficie di stampa.
   NOTA: La coordinazione tra la pompa della siringa e la stampante è determinata empiricamente a seconda della velocità di estrusione, della velocità con cui la testina si sposta verso il primo punto di stampa e della posizione iniziale della testina. Se la posizione iniziale della testina di stampa è di 20 mm, con una velocità di 9.000 mm/min e una velocità di estrusione di 0,1 mL/h, avvia la pompa della siringa immediatamente dopo l'inizio della stampa. Se la velocità di estrusione viene modificata da 0,1 mL/h a 0,3 mL/h, attendi 2−3 secondi per avviare la pompa della siringa dopo l'inizio della stampa.
10. Ferma la pompa della siringa non appena la testina di stampa arriva all'ultimo punto di stampa. Ferma la pompa della siringa prima che la testina si sollevi alla fine del processo di stampa, altrimenti l'eccesso di bio-inchiostro cadrà sul substrato di stampa riducendo la risoluzione di stampa.
11. Per la costruzione di strutture 3D, controlla tutti i movimenti della testina di stampa nell'editor di codice G. Digita l'altezza di stampa del primo strato. Aumentare il valore Z nel G-code di 0,2 millimetri per il secondo strato per aumentare l'altezza di stampa. Successivamente, aumentare il valore Z di 0,1 millimetri quando si passa a uno strato superiore. Non muovere la lastra durante il processo di stampa.
12. Per misurare la larghezza e l'altezza dell'idrogel stampato, si utilizza una righello in acciaio posizionata sotto o accanto al campione.

2. Crescita e test dell'efficacia della produzione di biofilm da parte di E. coli

1. Incubare i campioni stampati a temperatura ambiente per 3−6 giorni per permettere la produzione dei componenti del biofilm (fibre del riccio). Immagini le placche con una fotocamera o uno scanner fluorescente.
2. Per sciogliere la matrice di alginati, aggiungere 20 mL di soluzione di citrato di sodio 0,5 M (pH = 7 regolato con NaOH) ai substrati di stampa e incubare per 2 ore con 30 giri/min di agitazione a temperatura ambiente. Scartare il liquido e visualizzare di nuovo le piastre per confrontarle con le immagini delle placche prima del trattamento con citrato.

Tabella 1: Processo di programmazione e spiegazioni del codice G per la stampa di un quadrato.

Comandi G-code	Compiti
G1 Z20 F9000	Sollevare l'asse Z a un'altezza di 20 mm con una velocità di movimento di 9.000 mm/min.
G1 X95 Y65 F9000	Spostati al punto di partenza della prima linea con una velocità di movimento di 9.000 mm/min.
G1 Z6 F9000	Spostarsi verso il basso nella direzione Z fino a una distanza di stampa corretta (qui Z = 6 mm).
G1 X95 Y105 F300	Punto finale della prima riga e punto di partenza della seconda linea.
G1 X135 Y105	Punto finale della seconda linea e punto di partenza della terza linea.
G1 X135 Y65	Punto finale della terza linea e punto di partenza della quarta linea.
G1 X95 Y65	Punto finale della quarta linea e punto di partenza della prima linea; Si forma un quadrato.
G1 Z20 F9000	Sollevare l'asse Z a un'altezza di 20 mm a 9.000 mm/min.
G1 X55 Y40 F9000	Spostati a una coordinata (55, 40) al di fuori dell'intervallo della piastra di Petri.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Polvere di brodo LB	Sigma-Aldrich	L3022
Oscillatore orbitale	VWR	89032-092	Modello 3500
Piastra di Petri	VWR	25384-326	150 x 15 mm
Rhamnose	Sigma-Aldrich	83650
Tubi di silicio	VWR	DENE 3100103/25
Pompa a siringa	ProSense B.V.	NE-300
Algiato di sodio	Sigma-Aldrich	W201502
Monobasico di citrato di sodio	Sigma-Aldrich	71498
Idrossido di sodio	VWR	28244.295