Indagine dell'attività microbica intestinale umana sugli esosaccacaridi

Abstract

Fonte: Hu, Y. et.al., Analisi delle Interazioni tra Endobiotici e Microbiota Intestinale Umano Utilizzando Sistemi di Fermentazione in Vitro Bath. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video dimostra l'analisi della produzione di acidi grassi a catena corta da parte del microbiota intestinale umano in risposta agli esosaccaridi. Questo evidenzia la separazione e quantificazione dei prodotti della fermentazione microbica tramite cromatografia gassosa. I risultati rivelano che gli esosaccaridi modulano i metaboliti microbici che influenzano la dinamica ospite-patogeno nell'intestino.

Protocollo

1. Effetti dell'esopolisaccaride (EPS) sulla produzione di acidi grassi a catena corta (SCFA) da parte del microbiota intestinale umano
   1. Aggiungi sopranattivi fermentati (1 mL) preparati nel passaggio 5,3 a 2 mL di tubi centrifughe.
   2. Aggiungere 0,2 mL di acido metafosforico al 25% (w/v) a ciascuno campione e mescolare accuratamente le soluzioni tramite vortex.
   3. Centrifuga le miscele a 13.000 x g per 20 minuti e trasferisci i soprannatanti in tubi nuovi.
   4. Contemporaneamente, si preparano soluzioni di 120 mM di acidi acetico, propionico, butirico, isobutirico, valerico e isovalerico. Poi, aggiungi 1 mL di ciascun acido preparato a 1,2 mL di acido metafosforico al 25% (w/v) e usalo come cocktail standard.
   5. Filtrare i campioni utilizzando una membrana da 0,22 μM.
   6. Rilevare le concentrazioni di SCFA utilizzando cromatografia a gas ad alte prestazioni.
      NOTA: Per la cromatografia a gas (GC) viene utilizzata una colonna FFAP InertCap (0,25 mM x 30 m x 0,25 μM). Le concentrazioni SCFA vengono poi quantificate in base alle aree di picco utilizzando il metodo standard interno a punto singolo nel pacchetto software GC Solution.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Filtri a membrana da 0,22 μm	Millipore	SLGP033RB	Utilizzo per filtrare i campioni
Crivello da 0,4 mm	Thermo Fischer	308080-99-1	Uso per preparare campioni fecali umani
Acetico	Sigma-Aldrich	71251	Campione standard per SCFA
Butyric	Sigma-Aldrich	19215	Campione standard per SCFA
Colonna capillare	SHIMADZU-GL	InertCap FFAP (0,25 mm × 30 m × 0,25 μm)	Utilizzato al rilevamento SCFA
Cromatografia gassistica	Shimadzu Corporation	GC-2010 Plus	Utilizzato al rilevamento SCFA
Isobutirico	Sigma-Aldrich	46935-U	Campione standard per SCFA
Acidi isovalerici	Sigma-Aldrich	129542	Campione standard per SCFA
Acido metafosforico	Sigma-Aldrich	B7350	Campione standard per SCFA
NaOH	Sigma-Aldrich	30620	Soluzione di base utilizzata per regolare il pH dei tamponi
Propionica	Sigma-Aldrich	94425	Campione standard per SCFA
Valeric	Sigma-Aldrich	75054	Campione standard per SCFA