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1. Installazione del microscopio e acquisizione in time-lapse
NOTA: Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per un microscopio a campo ampio invertito con autofocus, un obiettivo olio PH3 a 100X/1,30 NA, uno stadio motorizzato X, Y, una telecamera sCMOS, una sorgente luminosa, filtri per proteine fluorescenti verdi, fluorescenti rossi o fluorescenti gialli, e una camera di incubazione a temperatura controllata. Questa camera mantiene le cellule protette dalla luce e a una temperatura costante.
- Preriscaldare la camera di incubazione e il microscopio a 32 °C per ~1 - 2 ore prima di iniziare la microscopia.
NOTA: A seconda dell'impianto del microscopio, il riscaldamento può richiedere più tempo. Il preriscaldamento è essenziale per ridurre la deriva e stabilizzare il sistema di controllo dell'autofocus. - Accendi il microscopio e avvia il software di controllo del microscopio. Seleziona l'obiettivo corretto e gli specchi e i filtri corretti per acquisire immagini con contrasto di fase, così come immagini di proteine fluorescenti verdi, fluorescenti rosse o fluorescenti gialle.
NOTA: Un microscopio viene tipicamente fornito con software preferito per il controllo e l'acquisizione dell'immagine del microscopio. Qui, veniva utilizzato un software disponibile in commercio (vedi la Tabella dei Materiali) per controllare il microscopio e l'acquisizione delle immagini. - Aggiungere una goccia di olio a immersione di alta qualità sulla lente obiettivo e sul fondo del campione, pre-incubato a 32 °C. Posizionare l'obiettivo nella posizione Z più bassa possibile per evitare di danneggiarlo quando il campione viene posizionato sul palco del microscopio. Posiziona la struttura metallica con il campione sul palco del microscopio, con il "lato foro" rivolto verso l'obiettivo. Fissa il campione saldamente nel portaspalchi.
- Concentrati sulle cellule spostando lo stadio nella direzione Z più vicino all'obiettivo. Muovi lentamente lo stadio quando l'olio cade sul lato inferiore del campione e l'obiettivo entra in contatto. Sposta lo stadio nella direzione X/Y finché più singole celle non sono visibili nella regione visiva, quando le celle sono nel piano focale. Assicurati che almeno una microsfera fluorescente sia nella regione visiva per allineare successivamente le immagini acquisite.
NOTA: In condizioni ottimali, si dovrebbe raggiungere una densità cellulare di 15 - 30 celle per regione visiva (2.048 x 2.048 pixel o 133,1 x 133,1 μm). - Apri il wizard Multi-Dimensional Acquisition del software di controllo del microscopio per impostare un esperimento in timelapse che consenta al microscopio di acquisire immagini a più lunghezze d'onda e posizioni di stadio, se necessario.
- Nella scheda principale, attiva Timelapse e Multiple Wavelengths. Ulteriori schede appariranno sul lato sinistro della finestra.
- Clicca sulla scheda Salvataggio e seleziona Directory per selezionare una cartella vuota sul disco rigido del computer e salvare le immagini acquisite. Attiva il nome base di Increment se esiste un file per assicurarti che i dataset consecutivi non sovrascrivano quelli precedenti. Poi assegna all'esperimento un nome con data e il nome o titolo della varietà dell'esperimento.
- Clicca sulla scheda Time-lapse per regolare i parametri del time-lapse. Imposta la durata a 24 ore e l'intervallo di tempo a 20 minuti. Il numero di Time Points cambierà automaticamente.
NOTA: L'intervallo di tempo ottimale dipende dall'esperimento e dalla funzione cellulare da analizzare. Acquisizioni frequenti di immagini possono causare fotosbiancamento. Pertanto, bisogna trovare empiricamente un compromesso tra risoluzione temporale e fotosbiancamento. Con un tempo di raddoppio di 4 - 6 ore, le immagini possono essere facilmente acquisite a intervalli di 5 minuti (o anche più brevi se desiderato) per la microscopia a contrasto di fase. Se si desidera una microscopia a fluorescenza su un arco temporale di 24 ore, le immagini dovrebbero essere registrate a intervalli di circa 15 - 30 minuti. - Clicca sulla scheda Lunghezze d'Onda . Seleziona il numero di lunghezze d'onda da acquisire per ogni immagine in ogni momento cambiando il numero.
NOTA: Per ogni lunghezza d'onda, apparirà una nuova scheda sul lato sinistro del " Wizard Acquisizione Multidimensionale " e le lunghezze d'onda verranno acquisite in ordine dall'alto verso il basso. Per ogni lunghezza d'onda, le impostazioni di acquisizione possono essere modificate separatamente. - Clicca sulla prima scheda della lunghezza d'onda dall'alto. Seleziona Contrasto di fase nella lista a tendina Illuminazione . Seleziona 100 ms per Exposure e seleziona Ogni Momento nel menu a tendina Acquisizione . Disattiva l'Esposizione Automatica selezionando Mai nella lista a tendina.
- Ripeti il passo 3.5.5 per ogni lunghezza d'onda da acquisire in ogni momento di tempo. Per l'installazione sperimentale e le proteine marcate fluorescenti descritte qui, si utilizzano i seguenti parametri per l'esposizione: 250 ms per le proteine di fusione mCherry, 200 ms per le proteine di fusione YFP (proteina fluorescente gialla) e 1.000 ms per le proteine di fusione GFP (proteine fluorescenti verdi).
NOTA: Le impostazioni ottimali di illuminazione per ogni ceppo e proteina fluorescente dovrebbero essere determinate in anticipo modificando l'intensità della lampada e il tempo di acquisizione dell'immagine per ciascuna lunghezza d'onda. Tempi di acquisizione dell'immagine troppo lunghi aumentano l'effetto fototossico e alla fine porteranno all'arresto della crescita e alla morte cellulare. Pertanto, bisogna ottenere un compromesso tra qualità dell'immagine e vitalità della cella. - Acquisire immagini da più posizioni di stadio per aumentare il numero di cellule registrate nello stesso esperimento.
- Per acquisire immagini da più posizioni di palco, attiva Multiple Stage Positions nella scheda Principale . Poi clicca sulla scheda Stage e clicca sul pulsante Live per vedere il campo visivo.
- Sposta lo stage nella direzione X/Y finché una regione di interesse (ROI) non è nel campo visivo. Salva le coordinate X e Y cliccando sul "+" nella scheda Stage . Sposta di nuovo il palco nella direzione X/Y finché non si trova un nuovo ROI e salva di nuovo le coordinate cliccando sul "+". Continua finché non si salva il numero desiderato di regioni.
NOTA: In caso di acquisizione di immagini a fluorescenza, assicurarsi che le regioni di interesse (ROI) non siano troppo vicine tra loro per minimizzare la fototossicità.
- Controlla ancora una volta che le celle siano a fuoco cliccando sulle diverse posizioni X e Y salvate e avvia l'autofocus hardware premendo AFC hold per mantenere costante la posizione Z salvata durante l'esperimento.
- Avvia le registrazioni time-lapse nel software di controllo del microscopio cliccando su Acquisisci nella procedura di acquisizione multidimensionale .
NOTA: Apparirà una finestra per ogni lunghezza d'onda acquisita e un'ulteriore finestra che mostra il numero di punti temporali acquisiti e il tempo fino alla prossima acquisizione dell'immagine. - Controlla che le celle siano ancora a fuoco dopo i primi momenti temporali delle registrazioni time-lapse per massimizzare la qualità delle immagini e rifocalizza se necessario.