Imaging time-lapse di cellule vive della predazione di Bdellovibrio bacteriovorus su E. coli

Abstract

Fonte: Makowski, Ł., et al. Imaging con cellule vive del ciclo vitale del predatore batterico Bdellovibrio bacteriovorus utilizzando la microscopia a fluorescenza a tempo indeterminato. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video dimostra l'imaging a fluorescenza in time-lapse di Bdellovibrio bacteriovorus che preda E. coli immobilizzata sotto un cuscinetto di agarosio, permettendo la visualizzazione in tempo reale della replicazione intracellulare e del rilascio dei discendenti per studiare la predazione batterica e le interazioni ospite-patogeno.

Protocollo

1. Conduzione della microscopia a fluorescenza time-lapse

1. Posiziona la piastra da 35 mm nel portapiastre di Petri in modo che non si muova durante l'esperimento. Applicare una goccia di olio a immersione (indice di rifrazione 1,518) sull'obiettivo e sul fondo della piastra da 35 mm.
2. Montare il supporto sul palco del microscopio rovesciato nella camera del microscopio.
3. Imposta le opzioni nel software di controllo del microscopio per raccogliere più immagini in diverse posizioni di palcoscenico nel tempo.
   1. Imposta l'ingrandimento (100x) e la lente policroma (GFP (proteina fluorescente verde)/mCherry). Usando un oculare e un campo luminoso (BF), trova il piano focale e apri il gestore della lista punti.
   2. Seleziona almeno 10 posizioni di interesse spostando il palco e memorizzando le coordinate di ciascuna posizione nel software del microscopio cliccando sul pulsante Segna il punto . Evita posizioni vicine per prevenire fotosbiancamento e fototossicità. Gira la valvola della fotocamera dall'oculare al monitor e calibra ogni punto impostando il piano focale e cliccando sul pulsante Sostituisci punto nel gestore della lista punti.
   3. Apri il designer dell'esperimento e imposta tutti i parametri sperimentali in ogni scheda come segue:
      1. Togliete il marchio della scatola di impilamento Z .
      2. Scegli i canali fluorescenti e imposta le impostazioni ottimali di illuminazione. Qui sono state utilizzate le seguenti impostazioni: per il canale mCherry, set di filtri mCherry (EX575/25; EM625/45), intensità del 50% e tempo di esposizione di 200 ms; per il canale GFP, set di filtri GFP (EX475/28; EM525/48), intensità del 50% e 80 ms; e per le immagini BF, canale POL, intensità 5% e 50 ms.
      3. Seleziona gli intervalli tra l'acquisizione delle immagini e il tempo totale dell'esperimento. Qui, sono stati eseguiti intervalli di 5 minuti durante le 10 ore dell'esperimento.
      4. Abilita la manutenzione del focus per le posizioni scelte (per il sistema usato qui, selezionando la casella Mantenere il focus con UltimateFocus ).
      5. Seleziona la cartella dati in cui i file immagine devono essere salvati automaticamente.
      6. Ricontrolla tutte le impostazioni nel controllo software del microscopio, poi avvia l'esperimento time-lapse.
4. Dopo la prima ora dell'esperimento, verifica che tutte le posizioni del palco siano ancora a fuoco. Regolare la messa a fuoco durante gli intervalli di tempo tra un'acquisizione e l'altra, se necessario.
5. Quando l'esperimento time-lapse è terminato, rimuovere la piastra di Petri e utilizzare la piastra da 35 mm con un tampone di agarosio secondo il protocollo di biosicurezza.
   NOTA: Tutti i sottopassaggi dopo il step 1.2 sono specifici per gli utenti DeltaVision Elite. I ricercatori che utilizzano altri sistemi devono regolare le impostazioni in base ai singoli sistemi.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Biologia Molecolare Certificata Agarose	BIO-RAD	161-3100	Agarosio a bassa fluorescenza per il tampone dell'agarosio
Figi	ImageJ	https://imagej.net/Fiji	Pacchetto di elaborazione immagini open source
Piatto inferiore di vetro 35 mm	ibidi	81218-200	Vetro non rivestito
Microscopio	GE	DeltaVision Elite	Microtiter Stage, modulo laser ultimate focus, DV Elite CoolSnap HQ2, assembly SSI FP DV, kit obj. Oly 100x olio 1.4 NA, prisma Nomarski 100x LWD DIC, ENV ctrl IX71 uTiter opaQ 240 V
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