Visualizzazione della distribuzione delle proteine batteriche in tre dimensioni tramite imaging a fluorescenza

Abstract

Fonte: Bratton, B. P., et al., Imaging tridimensionale delle cellule batteriche per rappresentazioni cellulari accurate e localizzazione precisa delle proteine. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video dimostra il metodo per acquisire e analizzare immagini di fluorescenza tridimensionali delle cellule batteriche per studiare l'organizzazione delle proteine a livello di singola cellula.

Protocollo

1. Imaging

1. Inserisci il vetrino sigillato sul microscopio e lascialo riposare per 5 minuti per equilibrare la temperatura con l'ambiente circostante. La sala del microscopio può trovarsi a una temperatura diversa rispetto alla sala di preparazione del campione.
2. Prendi una pila z fluorescente del campione.
   NOTA: Lo stack z dovrebbe coprire completamente il campione con una distanza z inferiore alla profondità del campo. Per un obiettivo 100x a 1,45 NA e una cellula di E. coli spessa ~1 μm, 40 passaggi a 100 nm per passo funzionano bene. Per celle più grandi o quelle che non si trovano perfettamente piatte sulla superficie, possono essere necessari 50 o più passaggi. Includere passaggi sufficienti e assicurarsi che il campione sia completamente sfocato sopra e sotto.
   1. Utilizzare il software associato al microscopio (vedi Tabella dei Materiali) per controllare il microscopio.
   2. Metti a fuoco sul centro della cellula usando le ruote di messa a fuoco del microscopio. Sotto acquisizione ND, si seleziona la casella Z per prendere uno z-stack. Clicca sul pulsante Home per impostare il centro della cella come punto di partenza. Imposta la dimensione dello Step a 0,1 μm e imposta la distanza a 4 μm. Assicurati che il dispositivo Z sia impostato sulla fase piezo.
   3. Imposta i canali fluorescenti sotto la finestra Lambda sulle impostazioni per le molecole fluorescenti che vengono immaginate. In questo esperimento sono stati utilizzati GFP e mCherry.
      NOTA: Prendere uno stack z aggiuntivo con la stessa dimensione e intervallo nel secondo canale colore se si desidera la distribuzione 3D di un canale fluorescente aggiuntivo. In questo esperimento, il mCherry citoplasmatico è stato utilizzato per determinare la forma cellulare e MreB-GFP è stato utilizzato come secondo canale di colore.
   4. Assicurati che l'Ordine dell'Esperimento sia impostato su lambda (serie z) in modo che prenda uno stack completo di z-stack in ogni canale colore prima di cambiare.
   5. Clicca su Esegui ora per iniziare l'acquisizione dell'immagine e salva il file una volta completata una o entrambe le z-stack.
   6. Sposta in una nuova area del pad e ripeti i passaggi 1.2.2-1.2.5.

2. Ricostruzione cellulare

1. Ritaglia le singole celle e salva le immagini come file tiff impilati in modo che ci sia solo una cella per file. Assicurati che questa cella sia ben isolata da qualsiasi altra cella (cioè circa 5 volte la mezza larghezza massima della funzione di sfocatura in xy).
   NOTA: Questo può essere fatto utilizzando software di analisi delle immagini liberamente disponibili (vedi Tabella dei Materiali).
   1. Disegna una casella intorno a una singola cella e duplica quella cella 2 volte, una volta per ogni canale. Assicurati che la casella duplicata dell'hyperstack sia selezionata e cambia il canale su 1 o 2, assicurandoti che le fette includano l'intero z-stack.
      NOTA: Se si esamina solo la forma delle cellule e non un'ulteriore proteina fluorescente, sarà presente un solo canale.
   2. Una volta che entrambe le pile sono disponibili, vai su Immagini | Pile | Strumenti | Concatena per combinare le immagini prima con il canale proteico e poi con il canale di forma.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Cotton fioc	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Usavano per applicare VaLaP
Scoperte di copertura	VWR	16004-302
Figi	ImageJ	https://fiji.sc	Usato per cro cells
Lanolina	Sigma-Aldrich	L7387	Combinare con paraffina e vaselina per ottenere VaLaP
Mezzo di crescita LB	BD Difco	DF0446173
M63 media	US Biological	M1015
MATLAB	Mathworks		Serviva per eseguire script di convoluzione in futuro
Vedute per microscopio	Fisher	12-550-133
Elementi NIS	Nkon
Paraffina	Sigma-Aldrich	327212
Vaselina	Equalizzare	49035-038-27
Piezo z stage	Nikon	77011589
Punte per pipette -p200	USA Scientific	1111-0730
Punte per pipette - p10	USA Scientific	1111-3730