Visualizzazione della distribuzione delle proteine batteriche in tre dimensioni tramite imaging a fluorescenza

Abstract

Fonte: Bratton, B. P., et al., Imaging tridimensionale delle cellule batteriche per rappresentazioni cellulari accurate e localizzazione precisa delle proteine. J. Vis. Esp. (2019)

Questo video dimostra il metodo per acquisire e analizzare immagini di fluorescenza tridimensionali delle cellule batteriche per studiare l'organizzazione delle proteine a livello di singola cellula.

Protocol

1. Imaging

1. Inserisci il vetrino sigillato sul microscopio e lascialo riposare per 5 minuti per equilibrare la temperatura con l'ambiente circostante. La sala del microscopio può trovarsi a una temperatura diversa rispetto alla sala di preparazione del campione.
2. Prendi una pila z fluorescente del campione.
   NOTA: Lo stack z dovrebbe coprire completamente il campione con una distanza z inferiore alla profondità del campo. Per un obiettivo 100x a 1,45 NA e una cellula di E. coli spessa ~1 μm, 40 passaggi a 100 nm per passo funzionano bene. Per celle più grandi o quelle che non si trovano perfettamente piatte sulla superficie, po....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	sigma-Aldrich	A9539
Cotton fioc	Puritan Medical Products Company LLC	S304659	Usavano per applicare VaLaP
Scoperte di copertura	VWR	16004-302
Figi	ImageJ	https://fiji.sc	Usato per cro cells
Lanolina	Sigma-Aldrich	L7387	Combinare con paraffina e vaselina per ottenere VaLaP
Mezzo di crescita LB	BD Difco	DF0446173
M63 media	US Biological	M1015
MATLAB	Mathworks		Serviva per eseguire script di convoluzione in futuro
Vedute per microscopio	Fisher	12-550-133
Elementi NIS	Nkon
Paraffina	Sigma-Aldrich	327212
Vaselina	Equalizzare	49035-038-27
Piezo z stage	Nikon	77011589
Punte per pipette -p200	USA Scientific	1111-0730
Punte per pipette - p10	USA Scientific	1111-3730