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1. Determinazione dei livelli di colonizzazione intestinale
NOTA: La colonizzazione intestinale è la metrica più utile nel modello del pesce zebra, poiché può essere utilizzata per confrontare la fitness relativa di vari ceppi di V. cholerae o gli effetti di mutazioni o knockout genici.
1. Eutanasia
1. Quando l'esperimento raggiunge il punto di arrivo desiderato, prelevare un campione dell'acqua infettiva (15 mL sono solitamente sufficienti) per consentire il conteggio dei batteri espulsi e la misurazione della diarrea (come il test di mucina, il contenuto proteico e/o l'OD), se desiderato.
2. Versare il resto dell'acqua attraverso una rete (per raccogliere i pesci) nella candeggina per uccidere la V. cholerae presente nell'acqua.
3. Inserire il pesce in un becher contenente acqua infettiva più 336 μg/mL di etil 3-aminobenzoato metanesulfonato (tricaina) e incubare il pesce in questa soluzione di tricaina per 20 minuti a RT.
NOTA: Le reti a rete sono state sterilizzate con una soluzione di candeggina al 10%.
2. Dissezione
1. Preparazione del pesce
1. Prendi un pesce dalla soluzione di tricaina con un cucchiaio di plastica usa e getta e lo metti sulla superficie di sezione.
2. Posizionare il pesce con il lato ventrale rivolto verso l'alto e fissarlo attraverso la mascella inferiore, con l'estremità smussata del perno inclinata lontano dal centro del corpo. Metti un altro perno appena dietro l'ano, anch'esso inclinato lontano dal corpo.
2. Esposizione del tratto intestinale
1. Tamponare la superficie ventrale del pesce con una salvietta senza lanugine immersa al 70% di etanolo.
2. Sterilizza un bisturi e le forbici Vannas immergendole al 70% di etanolo e fiammandole.
3. Fare una piccola incisione longitudinalmente nella pancia, appena sotto la pelle, penetrando le scaglie e usando il bisturi. Fai attenzione a non tagliare troppo in profondità, poiché il tratto intestinale si trova appena sotto la pelle.
4. Usando le forbici, estendere l'incisione con cura lungo tutta la lunghezza del corpo, tagliando non più a fondo del livello della pelle ed evitando l'ano.
5. Effettuare due tagli laterali con le forbici verso la testa del pesce per permettere un'apertura all'incisione.
6. Fissare la pelle su ciascun lato delle incisioni laterali alla superficie di sezione, inclinando i perni verso l'esterno, lontano dal corpo.
NOTA: Le punte dei perni venivano precedentemente sterilizzate con la fiamma con alcol.
3. Rimozione del tratto intestinale
NOTA: Il tratto intestinale dovrebbe essere visibile come un tubo pallido e molto sottile sopra gli altri organi.
1. Sterilizza a fuoco le pinze e poi utilizzale per rimuovere l'intero tratto intestinale (tipicamente lungo 12–15 mm). Inserire l'intestino in un tubo di omogeneizzazione contenente perline di vetro (vedi passaggi 1.3.1–1.3.2) e 1 mL di 1x PBS o LB, sul ghiaccio.
3. Omogeneizzazione
1. Preparare in anticipo i tubetti di omogeneizzazione versando ~1,5 g di perline di vetro da 1 mm in tubi a tappo a vite da 2 mL (riempili circa a metà) e poi sterilizzarli tramite autoclav.
2. Aggiungi 1 mL di LB sterile o 1x PBS.
3. Una volta che gli intestini di pesce zebra sono stati aggiunti (passo 1.2.3.1) ai tubi, avvita i tappi molto stretti e poi fissa i tubi nell'omogeneizzatore a vortice.
4. Omogeneizzare i campioni per 1 minuto alla temperatura massima, poi raffreddarli sul ghiaccio per 1–2 minuti. Ripeti ancora una volta questo ciclo di omogeneizzazione per ottenere un'omogeneizzazione completa. Nota: Funzionano anche diversi metodi alternativi per l'omogeneizzazione.
4. Quantificazione dei livelli di colonizzazione intestinale
1. Preparare le provette (piccole provette di vetro o microcentrifughe da 1,5 mL) per la diluizione seriale dell'omogeneato aggiungendo 900 μL di LB o 1x PBS a ciascuna provetta. Per ogni pesce, si preparano 5–6 tubi e si effettuano diluizioni seriali di 10 volte dell'omogeneato intestinale aggiungendo 100 μL di omogeneato al primo tubo, vortice per mescolare e poi aggiungendo 100 μL dal primo tubo al secondo.
2. Ripetere questa procedura finché tutte le diluizioni non sono state preparate.
3. Placca 100–200 μL di ciascuna diluizione su piastre agar LB contenenti 100 μg/mL di streptomicina (se si utilizzano ceppi resistenti alla streptomicina) e 40 μg/mL di X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranoside). Incubare le placche a 30 °C per 16–18 ore.
4. Dopo l'incubazione notturna, contare le colonie di V. cholerae sulle lastre, utilizzando un contatore automatico o contando manualmente le colonie; È utile segnare le colonie contate con una punta a marcatore.
5. Determinare la CFU per intestino di pesce moltiplicando il conteggio delle placche per il fattore di diluizione della sospensione, tenendo conto del volume placcato.