Colonizzazione intestinale e induzione della diarrea da parte di Vibrio cholerae negli adulti del pesce zebra

Abstract

Fonte: Nag, D., et.al. Quantificazione della colonizzazione e della diarrea da Vibrio cholerae nel modello adulto di pesci zebra. J. Vis. Esp. (2018)

Questo video mostra l'inoculazione di pesci zebra adulti con un ceppo patogeno di Vibrio cholerae per studiare la colonizzazione intestinale e gli esiti delle malattie. Mostra come le tossine batteriche compromettano l'integrità intestinale, causando perdite di liquidi, secrezione di muco e diarrea acquosa prima che i pesci siano preparati per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Inoculazione del pesce zebra tramite immersione
   NOTA: Questo modo di esposizione assomiglia al naturale corso dell'infezione.
   1. Preparazione del Vibrio cholerae
      1. Inoculare 5 mL di brodo di lisogenesi (LB) con una colonia isolata di V. cholerae da una piastra LB e incubarla a 37 °C con agitazione (180 rpm) per 6–8 ore (coltura notturna).
      2. Inoculare 25 mL di medium LB fresco autoclaviato in una fiaschetta conica da 250 mL con 50 μL della coltura notturna sopra indicata. Incubarlo per 16–18 ore a 37 °C con scuotimento (150 giri/min).
      3. Leggi la densità ottica a 600 nm (OD₆₀₀) di una diluizione 1/10 della coltura notturna per stimare il numero di batteri per mL (OD₆₀₀ = 1 è ~10⁹ CFU/mL).
      4. Preleva le celle centrifugando a 6.000 g per 10 minuti. Rimuovi il substrato con una pipetta o versalo in una soluzione disinfettante. Risospendere le cellule in PBS sterile alla concentrazione desiderata, tipicamente tra 1 x 10⁷ e 1 x^{10 10} per ml di PBS.
         NOTA: Qui ci riferiamo all'acqua autoclaviata a osmosi inversa contenente 60 mg/L di sali marini come acqua di infezione sterile.
   2. Inoculazione e incubazione
      1. Metti quattro o cinque pesci zebra in un becher da 400 mL contenente 200 mL di acqua di infezione sterile.
      2. Aggiungere 1 mL di V. cholerae per ottenere la concentrazione di infezione desiderata (tipicamente 5 x 10⁴ a 5 x^{10 7} CFU/mL) in 200 mL di acqua infettiva.
      3. Copri il becher con un coperchio perforato per evitare che il pesce salti fuori; la parte superiore di una scatola a punta da 200 μL funziona bene per questo.
      4. Etichetta ogni becher e mettili in un incubatore a fronte di vetro a 28 °C per tutta la durata dell'esperimento.
   3. Procedura per l'esposizione transitoria
      NOTA: Un'esposizione transitoria a V. cholerae (tipicamente 6 ore) seguita dalla rimozione dei batteri inoculatori è utile per studiare la trasmissione e per una quantificazione più accurata dei batteri escreti.
      1. Dopo 6 ore di esposizione, versa l'acqua del becher attraverso una rete per raccogliere i pesci. Getta l'acqua infetta in un contenitore di candeggina per uccidere V . cholerae.
      2. Metti il pesce rimosso in un becher di 200 mL di acqua sterile per l'infezione. Lascia che i pesci nuotino in quest'acqua pulita per 5 minuti per rimuovere i batteri superficiali dal pesce.
      3. Ripeti la procedura con la rete e metti i pesci in un nuovo becher con acqua sterile da 200 mL. Tieni i pesci in questo becher per tutta la durata dell'esperimento.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumento
Incubatore	NUAIRE, Plymouth, MN	Flusso automatico
Materiali
Becher di vetro da 400 ml	Pyrex
Coperchi perforati	Portapunte micropunta con fori dalla scatola delle punte
Sistema di acquario	Aquaneering, San Diego, CA
Purificatore d'acqua RO	Aqua FX	TK001
Reti da pesca	Marina
Cibo per pesci	Pinna tetra
Placca di Petri	Fisher Brand, Hampton, NH	FB0875713
Tubo centrifuga da 1,5 ml	Midsci, Valley Park, MO	AVSS1700
Provette	Pyrex	9820
Micropipette	Sartorius Biohit, Göttingen, Germania	M1000/M200/M20
Consigli	Genesee Scientific, San Diego, CA	24-150RS/24-412
LB medium
Triptone	BD in Bioscienze, San Jose, CA	211705
Estratto di lievito	BD in Bioscienze, San Jose, CA	212750
NaCl	Fisher Scientific, Hampton, NH	BP358-212
Agar	BD in Bioscienze, San Jose, CA	214010