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1. Preparazione di piastre per il Mezzo di Crescita dei Nematodi (NGM) per testare gli effetti di diversi batteri sulla permeabilità intestinale di Caenorhabditis elegans (C. elegans)
- Mettere 1,25 g di peptone, 1,5 g di NaCl, 8,5 g di agar, un agitatore magnetico e 487,5 mL di acqua distillata in una bottiglia di vetro da 500 mL.
- Mescola bene la miscela, autoclava la miscela per 15 minuti a 121 °C e raffredda la miscela a 55 °C in un bagno maria per 30 minuti.
- Rimuovere il substrato dal bagno d'acqua, aggiungere i componenti (0,5 mL di 1 M CaCl2, 0,5 mL di colesterolo, 0,5 mL diMgSO 4, 12,5 mL di KPO4) al NGM e mescolare bene.
NOTA: Tutti i singoli componenti devono essere autoclavati tranne il colesterolo (disciolto in etanolo assoluto), e ogni fase sperimentale deve essere eseguita su un banco pulito. - Distribuire 20 mL di NGM in ciascuna piastra di Petri da 90 x 15 mm e lasciare che l'agar si solidifichi su un banco pulito a temperatura ambiente (circa 20 °C). Le piastre NGM possono essere conservate fino a un mese a 4 °C.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. Le piastre NGM utilizzate per la colorazione con FITC-dextrano (Fluorescein isotiocianato-dextrane) furono preparate. 10 mL di NGM venivano distribuiti in ciascuna piastra di Petri da 60 x 15 mm e lasciati solidificarsi su un banco pulito a temperatura ambiente (circa 20 °C). - Rimuovi la coltura batterica dal frigorifero a 4 °C e svuota accuratamente la coltura prima di spargerla sulle piastre NGM.
- Aggiungere un totale di 800 μL della coltura batterica a ciascuna piastra nuova di NGM e lasciare asciugare le piastre in un incubatore a 20 °C durante la notte.
NOTA: Per il primo esperimento (Figura 1), sono state preparate due piastre NGM con E. coli OP50, una piastra NGM con P. aeruginosa PAO1 e una lastra NGM con E. faecalis KCTC3206. Per il secondo esperimento (Figura 2), sono state preparate due piastre NGM con E. coli OP50 vive, una piastra NGM con P. aeruginosa PAO1 vivo e una piastra NGM con P. aeruginosa PAO1 inattivata dal calore.
3. Preparazione di C. elegans sincronizzati con l'età
- Coltiva i vermi su una piastra NGM solida e nutrili con E. coli OP50 fino a raggiungere la popolazione desiderata.
- Sincronizza le uova utilizzando il metodo della deposizione a tempo o il trattamento con soluzione sbiancante
4. Trattamento dei batteri e alimentazione con FITC-dextrano
- Incubare le uova sincronizzate con l'età a 20 °C per 64 ore su piastre NGM integrate con E. coli OP50 vivo come cibo.
- Lavare le larve L4 sincronizzate con l'età con un tampone S e trasferirle (più di circa 500 vermi) alle piastre NGM di trattamento contenenti diversi batteri e sostanze chimiche. Incubateli a 20 °C per 48 ore.
NOTA: Il tempo di trattamento può variare da 24 a 72 ore, a seconda dei batteri e delle sostanze chimiche utilizzate. L'effetto terapeutico o preventivo della DIM può essere valutato anche pretrattando i vermi con patogeni e poi trattandoli con DIM (l'effetto terapeutico) oppure pretrattando i vermi con DIM e poi con patogeni (effetto preventivo). - Per preparare le piastre integrate con FITC-dextran, miscela 2 mL di E. coli OP50 inattivato al calore con 4 mg di FITC-dextran. Poi, dividere 100 μL della miscela FITC-dextrano ed E. coli OP50 in venti piastre di agar NGM fresche (60 mm x 15 mm) e lasciare asciugare le lastre per 1 ora su un banco pulito.
NOTA: La concentrazione finale di FITC-destroano in ogni piastra NGM sarà di 20 μg/mL. - Preparare cinque piastre NGM contenenti E. coli OP50 senza FITC-destrono per il trattamento di controllo del veicolo. A tal fine, dividere 100 μL di E. coli OP50 inattivati a calore su ciascuna piastra di agar NGM fresca (60 mm x 15 mm) e lasciare asciugare le piastre per 1 ora su un banco pulito.
NOTA: Per ogni esperimento indipendente, sono necessarie quindici piastre NGM integrate con FITC-dextran e cinque piastre NGM senza FITC-destroano. - Dopo 48 ore di trattamento (dal passo 7.2), lavare i vermi con S-buffer, trasferire i vermi sulle piastre integrate con FITC-dextrano e sulle placche NGM senza FITC-dextran, e incubare le placche durante la notte (14–15 ore).
NOTA: Per ogni gruppo di trattamento sono necessarie 5 repliche della colorazione FITC-dextrano (o alimentazione di controllo del veicolo). - Lava i vermi con il tampone a S e lasciali infilare nella fresca piastra di agar NGM per 1 ora.
NOTA: Per ogni esperimento indipendente, sono necessarie un totale di 20 lastre NGM fresche. In questo passaggio, puoi utilizzare la piastra NGM integrata o senza E. coli OP50. - Aggiungere 50 μL di soluzione al 4% di formaldeide in ciascun pozzetto di una piastra nera a 96 pozzi a fondo piatto. Trasferire circa 50 vermi da ciascuna piastra NGM in ciascun pozzo per misurazioni di fluorescenza. Dopo 1-2 minuti, rimuovere accuratamente tutta la formaldeide da ogni pozzo e aggiungere 100 μL di mezzo di montaggio per rivestire i pozzi.
NOTA: La soluzione di formaldeide (4%) viene utilizzata per immobilizzare e fissare i vermi. Per ogni gruppo di trattamento vengono utilizzati 5 pozzi (5 replicati) per l'analisi delle immagini.
5. Imaging di C. elegans con il sistema di imaging operetta e determinazione della permeabilità intestinale misurando la captazione di fluorescenza FITC-dextrano
NOTA: La stereomicroscopia fluorescente può essere utilizzata per l'analisi delle immagini al posto del sistema Operetta.
- Acquisire immagini di fluorescenza e misurare l'intensità di fluorescenza utilizzando il sistema di imaging ad alto contenuto Operetta e analizzare le immagini con il software Harmony.
- Nel software Harmony, premi l'icona Apri il coperchio per aprire il coperchio e inserire il piatto nella macchina.
- Imposta i parametri.
- Clicca su impostare, seleziona il tipo di piastra (Corning a 96 pozzi a fondo piatto) e aggiungi i canali (campo chiaro ed EGFP).
- Regola la disposizione. Vai alla selezione Layout, poi seleziona Traccia e regola i parametri (prima immagine a 1 μm, numero di piani è 10, distanza è 1 μm).
- Seleziona uno dei pozzi di trattamento e un campo di cattura e premi Test per verificare se le immagini sono soddisfacenti nella sezione Run experiment .
- Se le immagini sono soddisfacenti, torna alla sezione Configura e premi l'icona Reset alla fine dello schermo. Successivamente, seleziona tutti i pozzi target e un numero adeguato di campi di cattura.
- Vai di nuovo su Esegui esperimento e inserisci il nome della targa, poi premi Start per iniziare l'elaborazione.
- Per misurare l'intensità della fluorescenza, vai nella sezione analisi delle immagini e inserisci l'immagine. Trova la cellula scegliendo il canale EGFP (proteina fluorescente verde potenziata) e il metodo B. Regola la soglia comune a 0,5, l'area a >200μm 2, il fattore di scambio a 3,0, la soglia individuale a 0,18 e il contrasto a più di 0,18. Poi, calcola le proprietà di intensità e scegli la media come uscita. Premi l'icona Applica per salvare la configurazione.
- Vai alla sezione Valutazione per misurare l'intensità ottenendo una mappa termica e una tabella dati. Imposta il parametro di lettura su Celle — Cellula di Intensità EGFP Media — Media per Pozzo e avvia la valutazione.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Per estrarre i dati da Operetta, clicca sul pulsante Imposta e scegli Gestione dati.
- Scegli Scrivi archivio, poi apri la sfila e seleziona il file.
- Per selezionare il file, clicca sul piccolo + segnale nell'angolo sinistro, poi clicca su Misura e scegli Nome della targa.
- Seleziona il file e clicca OK.
- Seleziona il percorso per salvare il file cliccando sul segnale Naviga nel percorso attivo.
- Clicca su Start per salvare il file dati.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
