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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
1. Preparazione di colture di Salmonella Typhimurium ΔAroA per il gancio orale dei topi
- Da una scorta di glicerolo congelata di S. Typhimurium ΔAroA, preparare una piastra striata utilizzando agar Luria-Bertani (LB agar) contenente 100 μg/mL di estreptomicina con un anello inoculante sterile. Incubare durante la notte a 37 °C. Le piastre striate possono essere conservate fino a una settimana a 4 °C.
- Un giorno prima dell'infezione, preparare l'antibiotico sciogliendo 0,5 g di estreptomicina in 2,5 mL d'acqua. Dopo aver sterilizzato la soluzione di streptomicina tramite filtro, si indossano i topi per via orale usando un ago da 22G a punta bulbosa e una siringa da 1 mL con 100 μL di soluzione di streptomicina (20 mg di streptomicina/dose). Utilizzando un annello inoculante, inocula 3 mL di brodo LB (50 μg/mL streptomicina) in un tubo di coltura con una singola colonia. Incubare la coltura di Salmonella in modo aerobico a 37 °C durante la notte con scuotimento a 200 Giri al Minuto (RPM).
- Il giorno dell'infezione, si prepara la dose finale eseguendo 2 diluizioni consecutive da 1/10 di colture notturne di Salmonella in soluzione salina fosfatata sterile (PBS). Questo porterebbe a un inoculo da 100 μL contenente circa 3 x 106 Unità Formanti Colonie (CFU).
- Utilizzando un ago gavage da 22G con punta bulbosa e una siringa da 1 mL, si sforna ogni topo con 100 μL di Salmonella preparata.
NOTA: Prepara colture di Salmonella utilizzando tecniche asettiche. La concentrazione finale di inoculazione di Salmonella può essere verificata tramite diluizioni seriali su agar LB con streptomicina.
2. Valutazione delle cariche di Salmonella nei tessuti
- Prepara microtubi a fondo rotondo con chiusura di 2 mL con 1 mL di PBS sterile e una perla in acciaio inox autoclavato. Prepesa i tubi prima della raccolta del tessuto.
- Dissezionare i tessuti cecalici e splenici di topi soppressi da esposizione a anidride carbonica. Raccogli tessuti da singoli animali in tubi separati. Pesa i tubi per determinare il peso dei tessuti.
- Omogeneizzare usando un apparecchio miscelatore per 15 minuti a 30 Hz. Trasferire 900 μL di PBS per pozzo in un megablocco da 96 pozzi da 2 mL. Pipetta 100 μL di tessuto si omogenea nel primo pozzo, miscela il pozzo ed esegue diluizioni seriali aggiungendo 100 μL ai pozzi successivi fino a ottenere una diluizione di 10⁻⁶. Lastra da 10 μL di ogni diluizione in triplicata su agar LB contenente 100 μg/mL di estreptomicina.
- Contare e moltiplicare la media CFU per un fattore di 100 poiché 10 μL del campione da 1000 μL sono stati placcati e il fattore di diluizione appropriato. Dividere il peso totale della CFU per i pesi del tessuto per determinare la CFU per grammo di tessuto.
NOTA: Conservare tutti i campioni sul ghiaccio o a 4 °C durante la lavorazione dei tessuti. Utilizzare punte a pipette a orifizio largo quando si eseguono diluizioni seriali con omogeneati tissutitori. Prepara in anticipo il megablocco a 96 pozzi contenente PBS.