Preparazione dell'inoculo di Gardnerella vaginalis per modellare infezioni urinarie ricorrenti nei topi

Abstract

Fonte: O'Brien, V.P. et al. Infezione urinaria ricorrente da Escherichia coli scatenata dall'esposizione alla vescica a Gardnerella vaginalis nei topi. J. Vis. Esp. (2020)

Questo video mostra la preparazione di un inoculo di Gardnerella vaginalis per stabilire un modello murino di infezione urinaria ricorrente.

Protocollo

1. Prepara l'inoculo di Gardnerella vaginalis
   NOTA: Tutti i passaggi vengono eseguiti in una camera anaerobica. I tempi ideali di incubazione delle colture variano tra i diversi ceppi di G. vaginalis, con alcuni ceppi che entrano nella fase stazionaria e persino iniziano a morire più rapidamente di altri. Pertanto, i tempi di incubazione dovrebbero essere determinati empiricamente per un determinato ceppo prima di eseguire esperimenti sui topi. Non si sa se altri o tutti i ceppi di G. vaginalis possano scatenare gli stessi effetti in questo modello.
2. Streak G. vaginalis sfila da brodo congelatore a -80 °C su un piatto NYCIII (senza antibiotici). Incubare la piastra a 37 °C anaerobicamente per 24 ore.
3. Nella camera anaerobica, inoculare 5 mL di mezzo anaerobico NYCIII con un anello di 1 μL di cellule (una singola colonia è insufficiente) dalla placca NYCIII e incubare in coltura statica a 37 °C in condizioni anaerobiche per 18 ore. Non includere antibiotici nel mezzo di crescita.
4. Determinare il diametro distretto⁶⁰⁰ della coltura usando uno spettrofotometro
   1. Centrifugare un volume definito (X) di coltura a 9600 × g per 1 minuto e aspirare il mezzo. Calcola il volume (Y) di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) per risospendere la pellet e ottenere la densità ottica (OD) desiderata dell'inoculo e ottenere 10⁸ unità formative di colonie (CFU) in 50 μL usando la seguente equazione: X mL × ODculture = Y mL ^{× ODinoculo} , risolvi YY = (X ml × ODculture) / ^{OD inoculo}
      NOTA: ^L'inoculo OD per JCP8151B^SmR è 5, ma questo deve essere determinato empiricamente per altri ceppi di G. vaginalis. Ad esempio, se si centrifuga 3 mL di una JCP8151B^SmR durante la notte con coltura liquida ODculture = 2,0: Y = (3 mL × 2,0) / 5,0; pertanto, risospendere il pellet in 1,2 mL PBS.
   2. Risospendere il pellet batterico in PBS alla concentrazione desiderata. Diluire serialmente e placcare l'inoculo per determinare la dose effettiva di inoculo utilizzata in ogni esperimento. Non affidarti solo ai valori OD.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Glucosio	Sigma	G7528	Per NYCIII G. vaginalis media di crescita
4-(2-idrossietil)-1-piperazina, etanosolfonico (HEPES)	Cellgro	25-060-CL	Per NYCIII G. vaginalis media di crescita
Cloruro di sodio	Sigma	S3014	Per NYCIII G. vaginalis media di crescita
Proteose peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	Per NYCIII G. vaginalis media di crescita
Estratto di lievito	Fisher	DF0127-17-9	Per NYCIII G. vaginalis media di crescita
Spettrofotometro	BioChrom	80-3000-45	Misurazione dell'OD600 batterico
Streptomicina	Gibco	11860038	Aggiungere a G. vaginalis le placche selettive NYCIII (1 mg/mL)