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Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato locale istituzionale per la cura degli animali e dal comitato veterinario JoVE.
1. Inoculazione intranasale di topi con Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) coltivato in biofilm
- Acquista topi e usali all'età desiderata.
NOTA: I topi di 3-4 mesi sono preferiti per modellare ospiti giovani, mentre topi di 21-24 mesi possono essere utilizzati per modellare individui anziani >65 anni. I dati presentati qui provengono da topi maschi C57BL/6. - Scongelare le aliquote batteriche coltivate nel biofilm su ghiaccio e centrifugare a 1.700 × g per 5 minuti. Rimuovere e scartare con cura il surnatante senza disturbare il pellet, lavare i batteri risospendendo il pellet in 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), e girare di nuovo a 1.700 × g per 5 minuti. Rimuovere il sovrantantante e risospendere il pellet nel volume necessario per raggiungere la concentrazione desiderata (puntare a 5 × 10 unità formanti dicolonia (CFU)/10 μL per l'inoculazione intranasale). Confermare le quantità di batteri somministrate placcando l'inoculo preparato su placche di agar sanguigno.
- Inoculare i topi per via intranasale con 5 × 106 CFU pipettando 5 μL dell'inoculo diluito in ciascun narido. Assicurati di tenere i topi ben fermi, stabilizzando la testa, finché il volume non viene inalato (di solito entro pochi secondi dall'introduzione del volume nelle narici). Eseguire questo passaggio in assenza di anestesia per prevenire l'aspirazione polmonare dell'inocolo.
2. Infezione virale con il virus influenzale A (IAV)
- A 48 ore dopo l'inoculazione intranasale con S. pneumoniae, si scongela il ceppo IAV di interesse sul ghiaccio.
NOTA: I dati qui presentati riguardano un ceppo adatto al topo del virus influenza A A/PR/8/34 H1N1, ottenuto tramite uno scambio collaborativo. - Una volta che il virus si è scongelato, diluire il virus nel PBS alla concentrazione desiderata; puntare a 20 unità formanti placca (PFU)/50 μL per infezioni intratracheali e 200 PFU/10 μL per infezioni intranasale. Per gruppi simulatamente infetti e solo batteri, si utilizza PBS per inoculare i topi.
- Applicare lubrificante oftalmico sugli occhi dei topi prima dell'anestesia. Anestetizzare i topi usando isoflurano al 5% e confermare l'anestesia con una stretta ferma al dito del piede.
- Una volta anestetizzato, si rimuove dalla camera dell'isoflurano e si infetta immediatamente i topi anestetizzati con 50 μL (20 PFU) di IAV intratracheale usando pinzette smussate per estrarre la lingua dalla bocca e pipettare il volume di liquido lungo la trachea.
- Metti i topi in una gabbia separata e monitora fino al completo recupero (sono in grado di mantenere la reclinazione sternale [in grado di sdraiarsi sul petto]).
- Dopo il recupero, inoculare immediatamente per via intranasale i topi con 10 μL (200 PFU) di IAV utilizzando il metodo di inoculazione nello step 1.3.
- Topolini domestici che hanno subito un'infezione batterica o virale singola o doppia con lo stesso gruppo di infezione e si sono separati dagli altri gruppi.